Datasets:

panosgriz
/

COVID-QA-el-small

data dict
{ "paragraphs": [ { "context": "Οι λειτουργικές γενετικές παραλλαγές στο DC-SIGNR συσχετίζονται με τη μετάδοση του HIV-1 από μητέρα σε παιδίhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211License:cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Η μετάδοση από μητέρα σε παιδί (MTCT) είναι η κύρια αιτία μόλυνσης από τον ιό HIV-1 στα παιδιά παγκοσμίως. Δεδομένου ότι ο υποδοχέας λεκτίνης τύπου C, μη σχετιζόμενη με την ιντεγκρίνη ICAM που αρπάζει ειδικά δενδριτικά κύτταρα (DC-SIGNR, επίσης γνωστό ως CD209L ή μη ιντεγκρίνη που αρπάζει ειδική για ήπαρ/λεμφαδένα ICAM (L-SIGN)), μπορεί να αλληλεπιδράσει με παθογόνα συμπεριλαμβανομένου του HIV-1 και εκφράζεται στη διεπαφή μητέρας-εμβρυϊκού, υποθέσαμε ότι θα μπορούσε να επηρεάσει το MTCT του HIV-1. ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΕΥΡΗΜΑΤΑ: Για να διερευνήσουμε τον πιθανό ρόλο του DC-SIGNR στην MTCT του HIV-1, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη γενετικής συσχέτισης του DC-SIGNR σε μια καλά χαρακτηρισμένη κοόρτη 197 μητέρων που είχαν μολυνθεί με HIV και των βρεφών τους που στρατολογήθηκαν στο Χαράρε. Ζιμπάμπουε. Βρέφη που έφεραν δύο αντίγραφα απλοτύπων DC-SIGNR H1 και/ή H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) είχαν 3,6 φορές αυξημένο κίνδυνο in utero (IU) (P = 0,013) μόλυνσης από HIV-1 και 5,7 φορές αυξημένο κίνδυνο ενδογεννητικής (IP) (P = 0,025) λοίμωξης HIV-1 μετά από προσαρμογή για έναν αριθμό μητρικών παραγόντων. Οι ενεχόμενοι απλότυποι Η1 και Η3 μοιράζονται δύο μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς (SNPs) στην περιοχή προαγωγέα (p-198A) και το εσώνιο 2 (int2-180A) που σχετίστηκαν με αυξημένο κίνδυνο και των δύο IU (P = 0,045 και P = 0,003, αντίστοιχα) και IP (P = 0,025, για int2-180A) μόλυνση HIV-1. Η παραλλαγή του προαγωγέα μείωσε τη μεταγραφική δραστηριότητα in vitro. Σε ομόζυγα βρέφη Η1 που φέρουν τόσο τις μεταλλάξεις p-198A όσο και int2-180A, παρατηρήσαμε μια 4-πλάσια μείωση στο επίπεδο των μεταγραφών DC-SIGNR του πλακούντα, επηρεάζοντας δυσανάλογα την έκφραση των ισομορφών που συνδέονται με τη μεμβράνη σε σύγκριση με βρέφη μη φορείς.011 011 ). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το DC-SIGNR παίζει κρίσιμο ρόλο στην MTCT του HIV-1 και ότι η μειωμένη έκφραση του DC-SIGNR του πλακούντα αυξάνει τον κίνδυνο μετάδοσης. Κείμενο: Χωρίς ειδικές παρεμβάσεις, το ποσοστό μετάδοσης του HIV-1 από μητέρα-παιδί (MTCT ) είναι περίπου 15-45% [1] . Το UNAIDS υπολογίζει ότι μόνο πέρυσι, περισσότερα από 400.000 παιδιά μολύνθηκαν παγκοσμίως, κυρίως μέσω MTCT και το 90% από αυτά ζούσε στην υποσαχάρια Αφρική. Στις χώρες που έχουν πληγεί περισσότερο, όπως η Ζιμπάμπουε, ο HIV-1 είναι υπεύθυνος για το ένα τρίτο όλων των θανάτων μεταξύ παιδιών κάτω των πέντε ετών. Η MTCT του HIV-1 μπορεί να συμβεί κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης (in utero, IU), του τοκετού (ενδοτοκετού, IP) ή του θηλασμού (μετά τον τοκετό, PP). Το υψηλό μητρικό ιικό φορτίο, ο χαμηλός αριθμός κυττάρων CD4, ο κολπικός τοκετός, η χαμηλή ηλικία κύησης έχουν αναγνωριστεί ως ανεξάρτητοι παράγοντες που σχετίζονται με την MTCT του HIV-1 [1] . Αν και τα αντιρετροϊκά μπορούν να μειώσουν το MTCT στο 2%, η περιορισμένη πρόσβαση σε έγκαιρα διαγνωστικά και φάρμακα σε πολλές χώρες του αναπτυσσόμενου κόσμου περιορίζει τον πιθανό αντίκτυπο αυτής της στρατηγικής. Η καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που δρουν στη διεπαφή μητέρας-εμβρυϊκού είναι ζωτικής σημασίας για το σχεδιασμό εναλλακτικών παρεμβάσεων έναντι της αντιρετροϊκής θεραπείας για την πρόληψη της μετάδοσης. Μη σχετιζόμενη με την ιντεγκρίνη ICAM-αρπαγή ειδικών δενδριτικών κυττάρων (DC-SIGNR, επίσης γνωστή ως CD209L ή Η μη ιντεγκρίνη που αρπάζει το ήπαρ/λεμφαδένα (L-SIGN)) μπορεί να αλληλεπιδράσει με μια πληθώρα παθογόνων παραγόντων συμπεριλαμβανομένου του HIV-1 και εκφράζεται σε τριχοειδικά ενδοθηλιακά κύτταρα πλακούντα [2] . Το DC-SIGNR είναι οργανωμένο σε τρεις διακριτές περιοχές, μια Ν-τελική κυτταροπλασματική ουρά, μια επαναλαμβανόμενη περιοχή που περιέχει επτά επαναλήψεις 23 αμινοξέων και μια Ο-τερματική περιοχή που εμπλέκεται στη σύνδεση του παθογόνου. Το εναλλακτικό μάτισμα του γονιδίου DC-SIGNR οδηγεί στην παραγωγή ενός ρεπερτορίου ισομορφών υψηλής διαφοροποίησης που περιλαμβάνει συνδεδεμένες με μεμβράνη και διαλυτές ισομορφές [3] . Έχει προταθεί ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ DC-SIGNR και HIV-1 μπορεί να ενισχύσει τη μεταφορά του ιού σε άλλους ευαίσθητους τύπους κυττάρων [2] αλλά το DC-SIGNR μπορεί επίσης να εσωτερικεύσει και να μεσολαβήσει στην εξαρτώμενη από το πρωτεάσωμα αποικοδόμηση των ιών [4] που μπορεί να επηρεάσει διαφορετικά το αποτέλεσμα Δεδομένης της παρουσίας του DC-SIGNR στη διεπαφή μητέρας-εμβρυϊκού και της αλληλεπίδρασής του με τον HIV-1, υποθέσαμε ότι θα μπορούσε να επηρεάσει το MTCT του HIV-1. Για να διερευνήσουμε τον πιθανό ρόλο του DC-SIGNR στο MTCT του HIV-1, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη γενετικής συσχέτισης του DC-SIGNR σε μια καλά χαρακτηρισμένη κοόρτη μητέρων μολυσμένων με HIV και των βρεφών τους που στρατολογήθηκαν στη Ζιμπάμπουε και προσδιορίσαμε συγκεκριμένα DC- Παραλλαγές SIGNR που σχετίζονται με αυξημένους κινδύνους μετάδοσης του HIV. Χαρακτηρίσαμε περαιτέρω τη λειτουργική επίδραση αυτών των γενετικών παραλλαγών στην έκφραση του DC-SIGNR και δείξαμε ότι επηρεάζουν τόσο το επίπεδο όσο και τον τύπο των μεταγραφών DC-SIGNR που παράγονται στον πλακούντα. Τα δείγματα αποτελούνταν από αποθηκευμένα εκχυλίσματα DNA που ελήφθησαν από 197 ζεύγη μητέρας-παιδιού. εγγράφηκε αμέσως μετά τον τοκετό στη δοκιμή συμπληρωμάτων βιταμίνης Α ZVITAMBO (Χαράρε, Ζιμπάμπουε) και ακολούθησε σε 6 εβδομάδες και 3μηνιαία διαστήματα έως και 24 μήνες. Το έργο ZVITAMBO ήταν μια τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο κλινική δοκιμή στην οποία συμμετείχαν 14.110 ζευγάρια μητέρας-παιδιού, από τον Νοέμβριο του 1997 έως τον Ιανουάριο του 2000, με κύριο στόχο τη διερεύνηση της επίδρασης της άμεσης μετά τον τοκετό συμπληρώματος βιταμίνης Α στο MTCT του HIV-1. Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη προέρχονταν από ζευγάρια μητέρας-παιδιού που κατανεμήθηκαν τυχαία στην ομάδα εικονικού φαρμάκου του έργου ZVITAMBO. Η αντιρετροϊκή προφύλαξη για HIV-1 προγεννητικές γυναίκες δεν ήταν διαθέσιμη στον δημόσιο τομέα της Χαράρε κατά τη διάρκεια της στρατολόγησης ασθενών με ZVITAMBO. Τα δείγματα λήφθηκαν διαδοχικά από δύο ομάδες: 97 ζευγάρια HIV-1-θετική μητέρα/HIV-1-θετικό παιδί και 100 HIV-1-θετική μητέρα/HIV-αρνητικό παιδί ζευγάρια. Η ορολογική κατάσταση της μητέρας προσδιορίστηκε με ELISA και επιβεβαιώθηκε με Western Blot. Τα βρέφη θεωρήθηκαν ότι είχαν μολυνθεί εάν ήταν οροθετικά στον HIV-1 σε ηλικία 18 μηνών ή μεγαλύτερα και είχαν δύο ή περισσότερα θετικά αποτελέσματα αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) HIV-1-DNA σε μικρότερες ηλικίες. 100 βρέφη θεωρήθηκαν μη μολυσμένα καθώς ήταν αρνητικά ELISA σε ηλικία 18 μηνών ή μεγαλύτερα και είχαν δύο αρνητικά αποτελέσματα DNA PCR από δείγματα που συλλέχθηκαν σε μικρότερη ηλικία. Από τα 97 μολυσμένα με HIV-1 βρέφη, 57 μολύνθηκαν IU, 11 είχαν μολυνθεί με PP και 17 μολύνθηκαν με PP όπως προσδιορίστηκε με αναλύσεις PCR δειγμάτων αίματος που συλλέχθηκαν κατά τη γέννηση, ηλικίας 6 εβδομάδων, 3 και 6 μηνών και σύμφωνα με ακολουθώντας τους ορισμούς που προσαρμόστηκαν από τον Bryson και τους συνεργάτες του [5] . Εν συντομία, τα βρέφη που ήταν θετικά στο DNA PCR κατά τη γέννηση μολύνθηκαν με IU. Βρέφη με αρνητικά αποτελέσματα PCR από δείγμα που ελήφθη κατά τη γέννηση αλλά που γίνονται θετικά στην ηλικία των 6 εβδομάδων μολύνθηκαν με IP. Βρέφη με αρνητικά αποτελέσματα PCR κατά τη γέννηση και την ηλικία των 6 εβδομάδων αλλά που στη συνέχεια έγιναν θετικά σε DNA PCR θεωρήθηκαν ότι είχαν μολυνθεί κατά τη διάρκεια της περιόδου PP. Στην ανάλυση που συγκρίνει τους 3 διαφορετικούς τρόπους MTCT, 12 μολυσμένα με HIV-1 βρέφη αποκλείστηκαν επειδή τα αποτελέσματα PCR δεν ήταν διαθέσιμα στην ηλικία των 6 εβδομάδων. Πλήρεις μέθοδοι στρατολόγησης, συλλογή βασικών χαρακτηριστικών, εργαστηριακές διαδικασίες έχουν περιγραφεί αλλού. ] . Η ανακατασκευή απλότυπου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Bayesian στατιστικής μεθόδου που εφαρμόστηκε στη ΦΑΣΗ [8] , έκδοση 2.1.1, χρησιμοποιώντας πολυμορφισμό απλού νουκλεοτιδίου (SNP) με ελάχιστη συχνότητα αλληλόμορφων (MAF) 2%. Εφαρμόσαμε τον αλγόριθμο πέντε φορές, χρησιμοποιώντας διαφορετικούς τυχαία δημιουργημένους σπόρους, και λήφθηκαν σταθερά αποτελέσματα σε όλες τις δοκιμές (Εικόνα 1). Δεκαπέντε SNP με ετικέτα απλότυπου (htSNPs) αναγνωρίστηκαν από το λογισμικό HaploBlockFinder [9] με MAF $5%. Αυτά τα htSNP προσδιορίστηκαν γονότυπος στα 197 βρέφη με άμεση ανάλυση αλληλουχίας PCR, όπως έχουμε περιγράψει προηγουμένως [7]. Ο γονότυπος της περιοχής επανάληψης του εξονίου 4 DC-SIGNR προσδιορίστηκε με ενίσχυση PCR ακολουθούμενη από μετανάστευση σε πηκτώματα αγαρόζης 1,5% [10] . Οι αλληλουχίες DNA στην περιοχή του προαγωγέα αναλύθηκαν με τη διεπαφή TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) για υποτιθέμενες θέσεις δέσμευσης παραγόντων μεταγραφής χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων TRANSFAC. Οι δοκιμασίες αναφοράς λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας τον φορέα pGL2-Basic πραγματοποιήθηκαν με τη σειρά για τη διερεύνηση της λειτουργικής επίδρασης των μεταλλάξεων στη δραστηριότητα του προαγωγέα DC-SIGNR. Γονιδιωματικό DNA από υποκείμενα ομόζυγα για τις παραλλαγές προαγωγέα και WT ενισχύθηκε από τη θέση νουκλεοτιδίου 2715 έως 21 και κλωνοποιήθηκε μεταξύ των πολλαπλών θέσεων κλωνοποίησης BglII και HindIII στον φορέα pGL2-Basic που φιλοξενεί ένα γονίδιο λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας αναφοράς (Invitrogenling Canada, Invitrogenling Canada, Invitrogen, Canada, Καναδάς). Όλοι οι ανασυνδυασμένοι κλώνοι επαληθεύτηκαν με προσδιορισμό αλληλουχίας DNA. Ο φορέας αναφοράς δοκιμής λουσιφεράσης πυγολαμπίδας συν-μορφομετατράπηκε σε αναλογία 10:1 με τον συστατικό εκφραστή της λουσιφεράσης Renilla, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, USA). Καλλιεργήσαμε κύτταρα HeLa σε πλάκες 6 φρεατίων (2610 5 κύτταρα) και τα επιμολύναμε την επόμενη μέρα χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη (Invitrogen) σύμφωνα με τον κατασκευαστή. Τα κύτταρα λύθηκαν και πραγματοποιήθηκαν δοκιμές λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας 20 mg εκχυλίσματος πρωτεΐνης σύμφωνα με τον κατασκευαστή (Promega) στις 44 ώρες μετά τη διαμόλυνση. Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας κανονικοποιήθηκε σε δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla. 0 mg, 0,5 mg ή 1 mg φορέας CMV-Tat επιμολύνθηκε με LTR-Luc ως θετικό μάρτυρα σε αυτά τα πειράματα. Πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς λουσιεράσης εις τριπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσο6 τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (S.E.M). Οι ιστοί του πλακούντα πρώτου χρόνου ελήφθησαν από αμβλώσεις μετά από εκούσια διακοπή της εγκυμοσύνης στο CHUM Hopital Saint-Luc (Μόντρεαλ, Καναδάς). Χρησιμοποιήθηκαν ιστοί από 3 Η1 (σχετιζόμενοι με MTCT του HIV-1) και 3 Η15 (άγριου τύπου) ομόζυγοι απλότυποι για την ανάλυση πιθανών διαφορών στην έκφραση ισομορφής. Τα συνολικά RNA του πλακούντα εξήχθησαν με MasterPure DNA και RNA Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τον κατασκευαστή. Θραύσματα που αντιστοιχούν στην κωδικοποιητική περιοχή DC-SIGNR μεταγράφηκαν αντίστροφα (RT) και στη συνέχεια ενισχύθηκαν με ένθετη PCR με τους ακόλουθους εκκινητές. RT εκκινητές RR, πρώτοι PCR RF και RR και δεύτεροι PCR RcF και RcR σύμφωνα με τον Liu και τους συνεργάτες του [11] . 1 mg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με Expand RT (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) σύμφωνα με τον κατασκευαστή και ενισχύθηκαν με PCR με DNA Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Τα κύρια προϊόντα PCR από τη δεύτερη αντίδραση PCR εκχυλίστηκαν με πήκτωμα με το κιτ εξαγωγής γέλης Qiagen (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canada) και κλωνοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ κλωνοποίησης TOPO TA για προσδιορισμό αλληλουχίας (Invitrogen). Για κάθε πλακούντα, επιλέχθηκαν τυχαία 15 διαφορετικοί κλώνοι και ενισχύθηκαν με εκκινητές Μ13 και αλληλουχήθηκαν με ABI PRISM 3100 αυτοματοποιημένο τριχοειδές sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Οι αλληλουχίες αναλύθηκαν και ευθυγραμμίστηκαν με την αλληλουχία αναφοράς GeneBank NM_014257 χρησιμοποιώντας λογισμικό Lasergene (DNA Stars, Madison, WI, USA). Ποσοτική έκφραση ισομορφών DC-SIGNR 1,5 mg πλακούντα RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας 2,5 mM Oligo RT σε όγκο 20 ml σύμφωνα με τον κατασκευαστή (Roche Applied Science). 15 ng ολικού cDNA σε τελικό όγκο 20 ml χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) σε Rotor Gene Realtime Rotary Analyzer (Corbett Life Science, Sydney, Αυστραλία). Χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από 2 άτομα σε κάθε ομάδα επειδή η ποιότητα RNA άλλων δεν ήταν κατάλληλη για ανάλυση qRT-PCR. Η ενίσχυση όλων των ισομορφών DC-SIGNR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ειδικό ζεύγος εκκινητών εξονίου 5 (Πίνακας S1). Ισόμορφες συνδεδεμένες με μεμβράνη ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για το εξόνιο 3, που αντιστοιχούν στην κοινή διαμεμβρανική περιοχή του DC-SIGNR. Οι εκκινητές στοχεύθηκαν στη σύνδεση εξωνίου-εξονίου και τα εκχυλίσματα RNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DNase (Fermantas International inc, Burlington, ΟΝ, Καναδάς) για να αποφευχθεί η ενίσχυση του μολυντικού DNA. Δημιουργήθηκαν τυπικές καμπύλες (50-500.000 αντίγραφα ανά αντίδραση) χρησιμοποιώντας σειριακή αραίωση ενός πλήρους μήκους DC-SIGNR ή πλασμιδικού DNA του εμπορίου GAPDH (Invitrogen). Όλες οι αντιδράσεις qPCR είχαν αποτελεσματικότητες που κυμαίνονταν από 99% έως 100%, ακόμη και παρουσία 20 ng μη ειδικών νουκλεϊκών οξέων, και επομένως μπορούσαν να συγκριθούν. Ο αριθμός αντιγράφων των άγνωστων δειγμάτων υπολογίστηκε τοποθετώντας τον μετρούμενο αριθμό κύκλου PCR (διασταυρούμενο κατώφλι) στην τυπική καμπύλη. Για τη διόρθωση των διαφορών τόσο στην ποιότητα όσο και στην ποσότητα RNA μεταξύ των δειγμάτων, τα επίπεδα έκφρασης των μεταγραφών κανονικοποιήθηκαν στις μεταγραφές γονιδίου αναφοράς GAPDH. Οι αλληλουχίες εκκινητών GAPDH παρασχέθηκαν ευγενικά από τον A. Mes-Masson στο CHUM. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως αριθμός αντιγράφων γονιδίου στόχου ανά 10 5 αντίγραφα GAPDH. Η αναλογία των ισομορφών που συνδέονται με τη μεμβράνη υπολογίστηκε ως Ε3/Ε5. Οι διαλυτές ισομορφές υπολογίστηκαν αφαιρώντας τις δεσμευμένες στη μεμβράνη από τις συνολικές ισομορφές. Πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς qPCR εις τριπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος6S.E.M. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το GraphPad PRISM 5.0 για Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, USA). Οι διαφορές στα βασικά χαρακτηριστικά και στις γονοτυπικές συχνότητες απλοτύπων ή htSNP συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων χρησιμοποιώντας την ανάλυση x 2 ή την ακριβή δοκιμή Fisher. Η ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των αναλογιών πιθανοτήτων (OR) για κάθε γονότυπο και βασικούς παράγοντες κινδύνου. Χρησιμοποιήθηκε πολλαπλή λογιστική παλινδρόμηση για να οριστούν ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες που προσδιορίστηκαν ως σημαντικοί στην ακατέργαστη ανάλυση. Τα OR και το διάστημα εμπιστοσύνης 95% υπολογίστηκαν με την ακριβή μέθοδο. Οι συγκρίσεις των συνεχών μεταβλητών μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν με το μη ζευγαρωμένο τεστ t Student με δύο ουρές όταν οι μεταβλητές ήταν κανονικά κατανεμημένες και με το τεστ Mann-Whitney U όταν διαφορετικά. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές στο P,0,05. Ελήφθη γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση από όλες τις μητέρες που συμμετείχαν στη μελέτη και τη δοκιμή ZVITAMBO και η έρευνα που αναφέρθηκε σε αυτό το έγγραφο εγκρίθηκε από το The We πραγματοποιήσαμε μια μελέτη συσχέτισης του πολυμορφισμού DC-SIGNR το 197 βρέφη που γεννήθηκαν από μητέρες που είχαν προσβληθεί από τον ιό HIV-1 που δεν είχαν λάβει θεραπεία, που στρατολογήθηκαν στο Χαράρε της Ζιμπάμπουε. Μεταξύ αυτών, 97 βρέφη ήταν μολυσμένα με HIV-1 και 100 βρέφη παρέμειναν μη μολυσμένα. Από τα 97 μολυσμένα με HIV-1 βρέφη, τα 57 είχαν μολυνθεί από IU, τα 11 ήταν μολυσμένα με ΙΡ και τα 17 είχαν μολυνθεί με ΡΡ. Ο χρόνος μόλυνσης δεν καθορίστηκε για 12 μολυσμένα με HIV-1 βρέφη. Τα βασικά χαρακτηριστικά των μητέρων και των βρεφών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Η ηλικία της μητέρας και ο αριθμός των κυττάρων CD4, το φύλο του παιδιού, ο τρόπος τοκετού, η διάρκεια της ρήξης της μεμβράνης και η ηλικία κύησης ήταν παρόμοια σε όλες τις ομάδες. Ωστόσο, το μητρικό ιικό φορτίο 0,29 000 αντίγραφα/ml συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο τόσο σε IU όσο και σε PP με αναλογίες πιθανοτήτων (OR) 3,64 (95% CI = 1,82-7,31, P = 0,0002) και 4,45 (95% CI = 1,50 -13,2, P = 0,0045) για μετάδοση του HIV-1, αντίστοιχα. Δεκαπέντε SNP με ετικέτα απλότυπου (htSNPs) που αντιστοιχούν στους 15 κύριους απλότυπους DC-SIGNR (Εικόνα 1) που περιγράφονται μεταξύ των κατοίκων της Ζιμπάμπουε [7] γονότυποι προσδιορίστηκαν στα δείγματα της μελέτης μας S2 και S3). Οι Η1 (31%) και Η3 (11%) ήταν οι πιο συχνοί απλότυποι που παρατηρήθηκαν (Εικόνα 1). Το ότι είναι ομόζυγο για τον απλότυπο Η1 συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο μετάδοσης HIV-1 τόσο IU (OR: 4,42, P = 0,022) όσο και PP (OR: 7,31, P = 0,016) (Πίνακας 2). Βρέφη που έφεραν δύο συνδυασμούς αντιγράφων απλοτύπων Η1 και/ή Η3 (H1-H1, H1-H3 ή H3-H3) είχαν αυξημένο κίνδυνο IU (OR: 3,42, P = 0,007) και IP (OR: 5,71, P = 0,025) αλλά όχι PP (P = 0,098) μόλυνση HIV-1 σε σύγκριση με βρέφη μη φορείς (Πίνακας 2). Οι τελευταίες συσχετίσεις παρέμειναν σημαντικές αφού έγινε προσαρμογή για το μητρικό ιικό φορτίο τόσο για IU (OR: 3,57, 95% CI = 1,30-9,82, P = 0,013) όσο και για IP (OR: 5,71, 95% CI = 1,40-23,3, P = 0,025) Μετάδοση HIV-1. Οι απλότυποι Η1 και Η3 μοιράζονται ένα σύμπλεγμα μεταλλάξεων (ρ-198Α, int2-391C, int2-180A, ex4RPT, int5+7C) (Εικόνα 1). Από αυτές, οι παραλλαγές p-198A και int2-180A συσχετίστηκαν σημαντικά με MTCT του HIV-1 (Πίνακας S2). Στην ανάλυση μη προσαρμοσμένης παλινδρόμησης, τα ομόζυγα βρέφη για τις παραλλαγές p-198A και int2-180A είχαν αυξημένο κίνδυνο IU (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, αντίστοιχα) και IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, αντίστοιχα) μόλυνση HIV-1 σε σύγκριση με ετερόζυγα βρέφη ή μη φορείς (Πίνακας 3). Όταν έγινε προσαρμογή για μητρικούς παράγοντες, μόνο η συσχέτιση με την παραλλαγή int2-180A παρέμεινε σημαντική για IU (OR: 3,83, 95% CI = 1,42-10,4, P = 0,008) και IP (O.R: 5,71, 95% CI = 1,40 -23,3, P = 0,025) Μετάδοση HIV-1. Έτσι, βρέφη ομόζυγα για την παραλλαγή DC-SIGNR int2-180A που περιέχεται στους απλότυπους Η1 και Η3 είχαν 4 φορές έως 6 φορές περισσότερες πιθανότητες να μολυνθούν από τον HIV-1 κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης ή κατά τον τοκετό, αντίστοιχα. Εναλλακτικό μάτισμα του DC-SIGNR γονίδιο στον πλακούντα παράγει ρεπερτόρια ισομορφών που συνδέονται τόσο με τη μεμβράνη όσο και διαλυτά [3] . Η σχετική αναλογία του δεσμευμένου στη μεμβράνη και του διαλυτού DC-SIGNR θα μπορούσε εύλογα να επηρεάσει την ευαισθησία στη μόλυνση από τον HIV-1 [11] . Υποθέσαμε λοιπόν ότι οι μεταλλάξεις DC-SIGNR που σχετίζονται με το MTCT του HIV-1 θα είχαν αντίκτυπο τόσο στο επίπεδο έκφρασης του DC-SIGNR όσο και στο ρεπερτόριο ισομορφής που παράγεται. Ερευνήσαμε την έκφραση μεταγραφής DC-SIGNR σε πλακούντες πρώτου χρόνου που λήφθηκαν μετά από εκλεκτική άμβλωση. Κλωνοποιήσαμε το DC-SIGNR από ιστούς πλακούντα με RT-PCR από 3 ομόζυγα δείγματα Η1 που περιείχαν και τις παραλλαγές DC-SIGNR p-198AA και int2-180AA που σχετίζονται με Μετάδοση HIV-1 και 3 δείγματα ομόζυγου άγριου τύπου (WT) (p-198CC, int2-180GG). Δεκαπέντε κλώνοι ανά δείγμα επιλέχθηκαν τυχαία για αλληλούχιση. Όπως ήταν αναμενόμενο, βρήκαμε ένα εκτεταμένο ρεπερτόριο μεταγραφών DC-SIGNR σε όλα τα δείγματα με 9 έως 16 διαφορετικές ισομορφές ανά άτομο. Ταυτοποιήθηκαν συνολικά 65 διακριτές μεταγραφές (Εικόνα S1), εκ των οποίων οι 3 ήταν μεταγραφές πλήρους μήκους. 64 από τους κλώνους της αλληλουχίας περιείχαν συνολικά 69 υποκαταστάσεις αμινοξέων με 3 νέα C άκρα και 2 πρόωρα κωδικόνια λήξης. Ωστόσο, η ποικιλομορφία αποδόθηκε κυρίως σε ολόκληρη τη διαγραφή του εξονίου 2 ή του εξονίου 3 ή σε παραλλαγές στο μήκος της περιοχής του λαιμού (εξόνιο 4) του DC-SIGNR. Η διαγραφή του εξονίου 3 εξαλείφει τη διαμεμβρανική περιοχή της πρωτεΐνης και οδηγεί στην έκφραση των διαλυτών ισομορφών DC-SIGNR [3] . Είναι ενδιαφέρον ότι η αφθονία των ισομορφών που συνδέονται με τη μεμβράνη στους ιστούς του πλακούντα των ομοζυγώτων Η1 φαίνεται να είναι χαμηλότερη από αυτή που παρατηρείται σε δείγματα από άτομα WT (Εικόνα S1). Η διαγραφή του εξονίου 3 επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση και υποθέτουμε ότι η παράλειψη του εξονίου 3, θα μπορούσε να οφείλεται στην παρουσία της μετάλλαξης int2-180A που παρατηρήθηκε σε βρέφη με απλότυπο Η1. Στην πραγματικότητα, αυτή η μετάλλαξη ιντρονίου βρίσκεται 180 bp προς τα κάτω από το εξόνιο 3 και δυνητικά τροποποιεί τα συμβάντα ματίσματος (Εικόνα 2Α). Επιβεβαιώσαμε ότι η διακύμανση στις αναλογίες μεταγραφής που παρατηρήθηκε μεταξύ των δύο ομάδων αντικατοπτρίστηκε επίσης στο επίπεδο της έκφρασης mRNA στον πλακούντα. Για να ποσοτικοποιήσουμε τις δεσμευμένες στη μεμβράνη έναντι των διαλυτών ισομορφών σε δείγματα πλακούντα από ομόζυγα βρέφη Η1 και WT, ενισχύσαμε την αλληλουχία του εξονίου 5 (Ε5) που υπάρχει σε όλες τις ισομορφές DC-SIGNR (συνολικές μεταγραφές). Στη συνέχεια ενισχύσαμε το εξόνιο 3 (Ε3) το οποίο διαγράφεται στις διαλυτές μορφές και στη συνέχεια υπολογίσαμε την αναλογία Ε3:Ε5. Βρήκαμε ότι οι ιστοί του πλακούντα από ομόζυγα βρέφη Η1 εκφράζουν σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό δεσμευμένου στη μεμβράνη DC-SIGNR (18%) σε σύγκριση με αυτό στα άτομα WT (36%) (P = 0,004) (Εικόνα 2Β) που υποδηλώνει ότι συμβαίνει παράλειψη εξονίου 3 πιο συχνά παρουσία της παραλλαγής DC-SIGNR int2-180A που σχετίζεται με MTCT του HIV-1. Η παραλλαγή DC-SIGNR int2-180A μεταδίδεται πάντα με τη μετάλλαξη προαγωγέα p-198A (Εικόνα 1). Στην ανάλυση μη προσαρμοσμένης παλινδρόμησης, η παραλλαγή p-198A συσχετίστηκε σημαντικά με IU αλλά όχι με IP και PP μετάδοση HIV-1 (Πίνακας 3). Η ανάλυση θέσης δέσμευσης υπολογιστικού παράγοντα μεταγραφής προβλέπει τον Πίνακα 1. Βασικά χαρακτηριστικά των παραγόντων κινδύνου μητέρας και βρέφους για ενδομήτρια (IU), ενδογεννητική (IP) και μετά τον τοκετό (PP) μετάδοση HIV-1 από μητέρα σε παιδί. Σχήμα 3Α). Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης του κατασκευάσματος παραλλαγής p-198A ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη του κατασκευάσματος προαγωγέα WT p-198C (αναλογία p-198C/A = 2, P = 0,006) (Εικόνα 3Β) υποδηλώνοντας ότι το DC-SIGNR p-198A επηρεάζει δραστηριότητα προαγωγέα. Οι άλλες μεταλλάξεις προαγωγέα (ρ-577C και ρ-323Α) που παρατηρήθηκαν στον πληθυσμό της Ζιμπάμπουε δεν επηρέασαν τη μεταγραφή DC-SIGNR σε αυτή τη δοκιμασία (Σχήμα S2). Για να προσδιορίσουμε τον καθαρό αντίκτυπο της μετάλλαξης DC-SIGNR p-198A στην έκφραση DC-SIGNR στον πλακούντα, ποσοτικοποιήσαμε τον απόλυτο αριθμό των ολικών και δεσμευμένων στη μεμβράνη μεταγραφών DC-SIGNR στα δείγματα Η1 ομοζυγώτη και άγριου τύπου πλακούντα όπως περιγράφεται νωρίτερα. Ο συνολικός αριθμός μεταγραφών DC-SIGNR προσδιορίστηκε ότι είναι 6856213 (αντίγραφα DC-SIGNR6S.E.M ανά 105 αντίγραφα GAPDH) στα δείγματα πλακούντα από ομόζυγα βρέφη Η1 και ήταν 4 φορές χαμηλότερος σε σύγκριση με αυτόν που βρέθηκε στους πλακούντες από άτομα WT ( 27816638, P = 0,011) (Εικόνα 3C). Όπως προτάθηκε προηγουμένως, η μετάλλαξη int2-180A μπορεί να προκαλέσει παράκαμψη του εξονίου 3 που οδηγεί σε χαμηλότερη παραγωγή δεσμευμένου στη μεμβράνη DC-SIGNR. Αν και η μείωση του συνολικού αριθμού μεταγραφών DC-SIGNR σε δείγματα ομόζυγου πλακούντα Η1 που περιείχαν και τις παραλλαγές p-198AA και int2-180AA επηρέασε την αναλογία των δεσμευμένων στη μεμβράνη και των διαλυτών ισομορφών, η επίδραση αυτών των μεταλλάξεων ήταν πιο έντονη στην Ισόμορφες δεσμευμένες στη μεμβράνη με 8 φορές μείωση (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6, P = 0,003) σε σύγκριση με 3 φορές μείωση στις συνολικές διαλυτές ισομορφές (H1 = 5686181,9 έναντι WT = 302C = 302C (Σχήμα 35 = 302C) ). Ως εκ τούτου, οι μεταλλάξεις DC-SIGNR p-198A και int2-180A που σχετίζονται με MTCT του HIV-1 μείωσαν σημαντικά το επίπεδο των ολικών μεταγραφών DC-SIGNR του πλακούντα, επηρεάζοντας δυσανάλογα την παραγωγή ισομορφών που συνδέεται με τη μεμβράνη. Πίνακας 3 . Συσχετίσεις μεταξύ του βρεφικού υποκινητή DC-SIGNR p-198 και των παραλλαγών του ιντρονίου 2 (int2)-180 και της ενδομήτριας (IU), ενδογεννητικής (IP) και μετά τον τοκετό (PP) μετάδοσης HIV-1 από μητέρα σε παιδί. Τα γενετικά μας αποτελέσματα, που υποστηρίζονται από δοκιμασία έκφρασης στον πλακούντα, υποδηλώνουν τη συμμετοχή του DC-SIGNR στο MTCT του HIV-1. Η ομοζυγωτία για τον απλότυπο Η1 συσχετίστηκε με μετάδοση IU στην ανάλυση μη προσαρμοσμένης παλινδρόμησης. Ωστόσο, η συσχέτιση εξαφανίστηκε μετά την προσαρμογή για τους μητρικούς παράγοντες πιθανώς λόγω του μικρού αριθμού των βρεφών Η1 ομοζυγώτων που αναλύθηκαν σε κάθε ομάδα. Οι Η1 και Η3 ήταν οι πιο συχνοί απλότυποι που παρατηρήθηκαν στον πληθυσμό της μελέτης και μοιράζονται ένα σύμπλεγμα μεταλλάξεων (Εικόνα 1). Η ομαδοποίηση των απλοτύπων Η1 και Η3 αύξησε την ισχύ της μελέτης και επέτρεψε τον εντοπισμό συγκεκριμένων μεταλλάξεων DC-SIGNR που σχετίζονται με το MTCT του HIV-1. Πράγματι, δύο μεταλλάξεις που μοιράζονται οι απλότυποι Η1 και Η3 συσχετίστηκαν με κάθετη μετάδοση του HIV-1. Το int2-180A συσχετίστηκε με 4 φορές αυξημένο κίνδυνο IU και 6 φορές αυξημένο κίνδυνο IP μετά από προσαρμογή για τους μητρικούς παράγοντες. Αν και η παραλλαγή p-198A συσχετίστηκε με μετάδοση IU, η συσχέτιση εξαφανίστηκε μετά την προσαρμογή για το μητρικό ιικό φορτίο. Ωστόσο, δείξαμε ότι αυτή η μετάλλαξη μειώνει τη μεταγραφική δραστηριότητα DC-SIGNR in vitro και παράγει χαμηλότερα επίπεδα μεταγραφών DC-SIGNR στους ιστούς του πλακούντα σε συνδυασμό με την παραλλαγή int2-180A. Δεδομένου ότι το int2-180A μεταδίδεται πάντα με το p-198A στους συνδυασμένους απλότυπους H1/H3 που σχετίζονται με MTCT, ενώ το p-198A μεταφέρεται σε άλλους μη συσχετισμένους απλότυπους (Εικόνα 1), μπορούμε να υποθέσουμε ότι η μετάλλαξη p-198A από μόνη της μπορεί να έχει δευτερεύουσα αποτέλεσμα in vivo ενώ σε συνδυασμό με την παραλλαγή int2-180A, και τα δύο δρουν για να μειώσουν το επίπεδο έκφρασης του DC-SIGNR του πλακούντα με αποτέλεσμα αυξημένο κίνδυνο MTCT του HIV-1. Η πλειοψηφία της μετάδοσης IU συμβαίνει κατά το τελευταίο τρίμηνο της εγκυμοσύνης (ανασκόπηση στο [12] ). Δείγματα πλακούντα πλήρους διάρκειας δεν ήταν διαθέσιμα για την τρέχουσα μελέτη και οι δοκιμασίες έκφρασης πραγματοποιήθηκαν σε ιστούς πλακούντα πρώτου χρόνου. Μια προηγούμενη μελέτη που εξέταζε το ρεπερτόριο των ισομορφών του πλακούντα DC-SIGNR σε δείγματα πλακούντα πλήρους διάρκειας έδειξε παρόμοια ποικιλομορφία μεταγραφών DC-SIGNR όπως και στους πρώτους ιστούς πλακούντα που μελετήθηκαν εδώ [3] . Ωστόσο, δεδομένου ότι τα επίπεδα έκφρασης του DC-SIGNR δεν συγκρίθηκαν ποτέ μεταξύ των διαφορετικών όρων εγκυμοσύνης, δεν είναι γνωστό εάν η έκφραση του DC-SIGNR ποικίλλει κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. Ωστόσο, είναι λογικό να υποθέσουμε ότι οι διαφορές μεταξύ των ατόμων τόσο στο ρεπερτόριο ισομορφής DC-SIGNR όσο και στα επίπεδα μεταγραφής που παρατηρήθηκαν μεταξύ των ομόζυγων βρεφών H1 και WT θα αντανακλώνται σε όλη τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. Μέχρι σήμερα, οι περισσότερες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στον πιθανό ρόλο του DC-SIGNR στην trans μόλυνση του HIV-1 in vitro [2, 10]. Ωστόσο, οι πολλαπλοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην trans μόλυνση και τον πλεονασμό μεταξύ των λειτουργιών λεκτίνης τύπου C καθιστούν δύσκολο τον προσδιορισμό της πραγματικής συμμετοχής του DC-SIGNR σε αυτόν τον τρόπο μόλυνσης in vivo [13, 14]. Η ισχυρή συσχέτιση που παρατηρήσαμε μεταξύ MTCT γενετικών παραλλαγών HIV-1 και DC-SIGNR που παράγουν χαμηλά επίπεδα DC-SIGNR στον πλακούντα υποδηλώνει ότι μηχανισμοί διαφορετικοί από τη διαμεσολαβούμενη από το DC-SIGNR τρανς λοίμωξη μπορεί να λειτουργούν κατά την κάθετη μετάδοση του HIV-1. Για παράδειγμα, το DC-SIGNR έχει επίσης αποδειχθεί ότι λειτουργεί ως υποδοχέας σύλληψης αντιγόνου HIV-1 [15] . Ο Chan και οι συνεργάτες του απέδειξαν πρόσφατα ότι τα διαμολυσμένα με DC-SIGNR κύτταρα CHO μειώνουν τους τίτλους του SARS-CoV με ενισχυμένη σύλληψη και αποικοδόμηση του ιού με τρόπο που εξαρτάται από το πρωτεάσωμα [4] . Δεδομένου ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν MHC-I και II, αποικοδομημένα ιικά αντιγόνα θα μπορούσαν στη συνέχεια να παρουσιαστούν στα κύτταρα του ανοσοποιητικού για να προκαλέσουν μια προσαρμοστική ανοσοαπόκριση [16, 17]. Ο υποδοχέας HIV-1 CCR5, αλλά όχι το CD4, συνεκφράζεται με το DC-SIGNR στα ενδοθηλιακά κύτταρα του πλακούντα και του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (BBB) [18, 19]. Η δέσμευση του HIV-1 gp120 στον υποδοχέα CCR5 στα ενδοθηλιακά κύτταρα θέτει σε κίνδυνο την ακεραιότητα του BBB και ενισχύει την προσκόλληση και τη μετανάστευση των μονοκυττάρων μέσω του BBB [20, 21]. Είναι επομένως πιθανό ότι η μειωμένη έκφραση του DC-SIGNR, ιδιαίτερα των ισόμορφων που συνδέονται με τη μεμβράνη, στα τριχοειδικά ενδοθηλιακά κύτταρα του πλακούντα μπορεί να ευνοήσει τη δέσμευση HIV-1 στον υποδοχέα CCR5, αντί για τον υποδοχέα DC-SIGNR, διευκολύνοντας τη μετανάστευση μητρικών κυττάρων μολυσμένων με HIV-1 κατά μήκος του φραγμού του πλακούντα με αποτέλεσμα τη μετάδοση IU του HIV-1. Η παραλλαγή int2-180A που περιέχεται στους απλότυπους Η1 και Η3 συσχετίστηκε με τη μετάδοση IP υποδηλώνοντας ότι το DC-SIGNR επηρεάζει επίσης τη μετάδοση του HIV-1 κατά την παράδοση. Λίγα είναι γνωστά για τους μηχανισμούς μετάδοσης του HIV-1 κατά την παράδοση. Η διέλευση μέσω του καναλιού γέννησης θα μπορούσε δυνητικά να εκθέσει τα βρέφη μέσω μιας πύλης του βλεννογόνου (πιθανώς οφθαλμική, δερματική ή γαστρεντερική), ενώ η προσβολή του πλακούντα κατά τη διάρκεια του τοκετού (σωματική ή φλεγμονώδης) μπορεί να ενισχύσει τη διαπλακουντιακή διέλευση των μητρικών μολυσμένων με HIV-1 κυττάρων στην εμβρυϊκή κυκλοφορία. 22, 23]. Μια τέτοια διαδικασία που ονομάζεται μικρομετάγγιση έχει προταθεί σε σχέση με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σε μια κοόρτη του Μαλάουι. Ο Kweik και οι συνεργάτες του βρήκαν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του μητρικού DNA στο αίμα του ομφάλιου λώρου και της IP μετάδοσης του HIV-1, υποδηλώνοντας ότι η διέλευση των μητρικών μολυσμένων κυττάρων μέσω του πλακούντα είναι πιθανό να συμβεί κατά τη διάρκεια του τοκετού [22]. Έτσι, με παρόμοιο τρόπο όπως προτάθηκε προηγουμένως για μετάδοση IU, το σχετικά χαμηλότερο επίπεδο DC-SIGNR στον πλακούντα ομόζυγων βρεφών που φιλοξενούν την παραλλαγή int2-180A θα μπορούσε να προάγει τη δέσμευση του HIV-1 με τον υποδοχέα CCR5 στα ενδοθηλιακά κύτταρα που επηρεάζει την ακεραιότητα του φραγμού του πλακούντα και διευκολύνοντας τη διέλευση των μητρικών μολυσμένων κυττάρων στην εμβρυϊκή κυκλοφορία κατά τη διάρκεια του τοκετού. Εκτός από το DC-SIGNR, άλλοι υποδοχείς HIV-1 είναι γνωστό ότι επηρεάζουν το MTCT του HIV-1 (ανασκόπηση στο [24] ). Γενετικές παραλλαγές στο CCR5 έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την κάθετη μετάδοση του HIV-1. Οι παραλλαγές του προαγωγέα CCR5 που είχαν ως αποτέλεσμα υψηλότερη έκφραση του υποδοχέα συσχετίστηκαν με αυξημένο κίνδυνο MTCT του HIV-1 στους Αφρικανούς της υποσαχάριας Αφρικής [25, 26]. Ο πολυμορφισμός διαγραφής 32-pb στο CCR5 έχει αποδειχθεί ότι προστατεύει από την κάθετη μετάδοση του HIV-1 [27] , αλλά αυτή η παραλλαγή ουσιαστικά απουσιάζει στους αφρικανικούς πληθυσμούς [28] . Οι υψηλοί αριθμοί αντιγράφων του CCL3L1, ενός ισχυρού κατασταλτικού προσδέματος HIV-1 για το CCR5, σχετίζονται με υψηλότερη παραγωγή χημειοκίνης και χαμηλότερο κίνδυνο MTCT του HIV-1 στα βρέφη της Νότιας Αφρικής [29, 30]. Η λεκτίνη που δεσμεύει τη μαννόζη (MBL) είναι ένας έμφυτος ανοσολογικός υποδοχέας που συντίθεται στο ήπαρ και εκκρίνεται στην κυκλοφορία του αίματος ως απόκριση στο σήμα φλεγμονής. Το MBL προάγει την εξάλειψη του παθογόνου με οψωνισμό και φαγοκυττάρωση, και η μειωμένη έκφραση του MBL που προκύπτει από τον πολυμορφισμό σε κωδικοποιητικές και μη κωδικοποιητικές περιοχές έχει συσχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο MTCT του HIV-1 [31, 32]. Σε αυτή τη μελέτη, καταδεικνύουμε για την πρώτη φορά, η πιθανή λειτουργική επίδραση των μεταλλάξεων του DC-SIGNR στην έκφρασή του στον πλακούντα και στην κατακόρυφη μετάδοση του HIV-1. Πιστεύουμε ότι η παρουσία του DC-SIGNR στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων του πλακούντα μπορεί να προστατεύσει τα βρέφη από τη μόλυνση HIV-1 συλλαμβάνοντας τον ιό και προάγοντας την αποικοδόμηση/παρουσίασή του. Ωστόσο, σε πλακούντα που περιέχει χαμηλά επίπεδα DC-SIGNR, ο HIV-1 δεσμεύει κατά προτίμηση το CCR5 στα ενδοθηλιακά κύτταρα με αποτέλεσμα την απώλεια της ακεραιότητας του φραγμού του πλακούντα και την ενίσχυση της διέλευσης των μητρικών κυττάρων που έχουν μολυνθεί με HIV-1 στην εμβρυϊκή κυκλοφορία που οδηγεί σε MTCT του HIV- 1. Αυτός ο μηχανισμός μπορεί επίσης να εφαρμοστεί σε άλλα κάθετα μεταδιδόμενα παθογόνα που είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν με το DC-SIGNR όπως οι ιοί HIV-2, ηπατίτιδας C και δάγκειος πυρετός και δικαιολογεί περαιτέρω διερεύνηση. Συσχετίσεις μεταξύ γονοτύπων επαναλαμβανόμενης περιοχής του εξονίου 4 του παιδιού DC-SIGNR και της μετάδοσης HIV-1 από μητέρα σε παιδί. CI, Διάστημα εμπιστοσύνης. Ν, αριθμός; NA; Δεν εφαρμόζεται; Ή, λόγος πιθανοτήτων μια τιμή P όπως προσδιορίζεται από τη δοκιμή Τετράγωνου Χ. β Σύγκριση μεταξύ γονότυπου και όλων των άλλων. Βρέθηκε στη διεύθυνση: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Εικόνα S1 Ρεπερτόριο μεταγραφών DC-SIGNR στον πλακούντα. Τα κύρια προϊόντα RT-PCR από εκχύλισμα RNA από 3 ομόζυγα δείγματα πλακούντα Η1 και 3 ομόζυγα WT πλακούντα καθαρίστηκαν, κλωνοποιήθηκαν και αλληλουχήθηκαν. Η αλληλουχία αναλύθηκε σύμφωνα με την αλληλουχία αναφοράς NCBI NM_014257. CT; κυτταροπλασματική ουρά, ΤΜ; διαμεμβρανικός τομέας; WT; άγριου τύπου Βρέθηκε στη διεύθυνση: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Εικόνα S2 Επίδραση της παραλλαγής προαγωγέα DC-SIGNR στη μεταγραφική δραστηριότητα σε δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης in vitro σε επιμολυσμένα κύτταρα HeLa. Σχετική έκφραση λουσιφεράσης από pGL2-Basic, γονικός φορέας χωρίς προαγωγέα. Έκφραση κατασκευάσματα προαγωγέα DC-SIGNR, που καλύπτουν την παραλλαγή p-577C ή την παραλλαγή p-323A, υπολογίστηκαν σχετικά με αυτήν την τιμή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται σε μέσες τιμές 6S.E.M τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης ακολουθούμενη από τη δοκιμή Dunnett για πολλαπλή σύγκριση χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της σχετικής έκφρασης λουσιφεράσης των ανταποκριτών παραλλαγής p-557C και p-323A έναντι του κατασκευάσματος άγριου τύπου (WT) (μη σημαντικό). 0 mg, 0,5 mg ή 1 mg φορέας CMV-Tat επιμολύνθηκε με LTR-Luc ως θετικό μάρτυρα σε αυτά τα πειράματα.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 370, "text": "Η μετάδοση από μητέρα σε παιδί (MTCT) είναι η κύρια αιτία μόλυνσης από τον ιό HIV-1 στα παιδιά παγκοσμίως" } ], "id": 262, "question": "Ποια είναι η κύρια αιτία μόλυνσης από τον ιό HIV-1 στα παιδιά;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2156, "text": "το DC-SIGNR παίζει κρίσιμο ρόλο στην MTCT του HIV-1 και ότι η μειωμένη έκφραση του DC-SIGNR του πλακούντα αυξάνει τον κίνδυνο μετάδοσης." } ], "id": 276, "question": "Τι παίζει τον κρίσιμο ρόλο στη μετάδοση του HIV-1 από τη μητέρα στο παιδί και τι αυξάνει τον κίνδυνο" }, { "answers": [ { "answer_start": 2450, "text": "περισσότερα από 400.000 παιδιά μολύνθηκαν παγκοσμίως, κυρίως μέσω MTCT και το 90% από αυτά ζούσε στην υποσαχάρια Αφρική" } ], "id": 278, "question": "Πόσα παιδιά μολύνθηκαν από τον ιό HIV-1 το 2008-2009, παγκοσμίως;" }, { "answers": [ { "answer_start": 30965, "text": "Οι υψηλοί αριθμοί αντιγράφων του CCL3L1, ενός ισχυρού κατασταλτικού προσδέματος HIV-1 για το CCR5, σχετίζονται με υψηλότερη παραγωγή χημειοκίνης και χαμηλότερο κίνδυνο MTCT του HIV-1 στα βρέφη της Νότιας Αφρικής" } ], "id": 316, "question": "Ποιος είναι ο ρόλος του C-C Motif Chemokine Ligand 3 Like 1 (CCL3L1) στη μετάδοση του HIV-1 από μητέρα σε παιδί;" }, { "answers": [ { "answer_start": 30490, "text": "Γενετικές παραλλαγές στο CCR5 έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την κάθετη μετάδοση του HIV-1. Οι παραλλαγές του προαγωγέα CCR5 που είχαν ως αποτέλεσμα υψηλότερη έκφραση του υποδοχέα συσχετίστηκαν με αυξημένο κίνδυνο MTCT του HIV-1 στους Αφρικανούς της υποσαχάριας Αφρικής" } ], "id": 312, "question": "Επηρεάζει ο υποδοχέας χημειοκίνης C-C τύπου 5 (CCR5) τη μετάδοση του HIV-1;" }, { "answers": [ { "answer_start": 31187, "text": "Η λεκτίνη που δεσμεύει τη μαννόζη (MBL) είναι ένας έμφυτος ανοσολογικός υποδοχέας που συντίθεται στο ήπαρ και εκκρίνεται στην κυκλοφορία του αίματος ως απόκριση στο σήμα φλεγμονής. Το MBL προάγει την εξάλειψη του παθογόνου με οψωνισμό και φαγοκυττάρωση," } ], "id": 318, "question": "Πώς επηρεάζει η λεκτίνη που δεσμεύει τη μαννανόζη (MBL) την εξάλειψη του παθογόνου HIV-1;" } ] } ] }
{ "paragraphs": [ { "context": "Ο ρόλος της S-Palmitoylation στο IFITM5 για την αλληλεπίδραση με το FKBP11 σε κύτταρα οστεοβλαστώνhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831License:cc-byAbstract: Πρόσφατα, μία από τις διαμεμβρανικές πρωτεΐνες της οικογένειας που προκαλούνται από ιντερφερόνη (IFITM), η IFITM3, έχει γίνει σημαντικός στόχος για τη δράση κατά της γρίπης A (H1N1 ) μόλυνση από ιό. Σε αυτή την πρωτεΐνη, μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση από λιπαρά οξέα ομοιοπολικά συνδεδεμένα με την κυστεΐνη, που ονομάζεται S-palmitoylation, παίζει κρίσιμο ρόλο για την αντιική δράση. Το IFITM3 διαθέτει τρία υπολείμματα κυστεΐνης για την S-παλμιτουλίωση στην πρώτη διαμεμβρανική περιοχή (ΤΜ1) και στον κυτταροπλασματικό (CP) βρόχο. Επειδή αυτές οι κυστεΐνες είναι καλά διατηρημένες στις πρωτεΐνες της οικογένειας IFITM των θηλαστικών, η S-παλμιτουλίωση σε αυτές τις κυστεΐνες είναι σημαντική για τις λειτουργίες τους. Το IFITM5 είναι μια άλλη πρωτεΐνη της οικογένειας IFITM και αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη 11 που δεσμεύει το FK506 (FKBP11) για να σχηματίσει ένα σύμπλοκο υψηλότερης τάξης σε κύτταρα οστεοβλαστών, το οποίο επάγει την έκφραση ανοσολογικά σχετικών γονιδίων. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τον ρόλο που παίζει η S-παλμιτοϋλίωση του IFITM5 στην αλληλεπίδρασή του με το FKBP11 στα κύτταρα, επειδή αυτή η αλληλεπίδραση είναι μια βασική διαδικασία για τη γονιδιακή έκφραση. Οι έρευνές μας χρησιμοποιώντας έναν καθιερωμένο ανταποκριτή, το 17-οκταδεκυνοϊκό οξύ (17-ODYA) και έναν αναστολέα για την S-παλμιτουλίωση, το 2-βρωμοπαλμιτικό οξύ (2BP), αποκάλυψαν ότι το IFITM5 ήταν S-παλμιτοϋλιωμένο επιπλέον του IFITM3. Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι τα υπολείμματα κυστεΐνης στην περιοχή ΤΜ1 και στον βρόχο CP ήταν S-παλμιτοϋλιωμένα στο IFITM5. Στη συνέχεια, αποκαλύψαμε με ανοσοκαταβύθιση και αναλύσεις στυπώματος western ότι η αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11 ανεστάλη παρουσία 2ΒΡ. Το μετάλλαγμα που δεν είχε τη θέση S-παλμιτοϋλίωσης στον τομέα ΤΜ1 έχασε την αλληλεπίδραση με το FKBP11. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 προάγει την αλληλεπίδραση με το FKBP11. Τέλος, διερευνήσαμε τον σχηματισμό οστικού οζιδίου σε κύτταρα οστεοβλαστών παρουσία 2BP, επειδή το IFITM5 αρχικά αναγνωρίστηκε ως παράγοντας σχηματισμού οστού. Το πείραμα οδήγησε σε μορφολογική εκτροπή του οστικού οζιδίου. Αυτό έδειξε επίσης ότι η S-παλμιτοϋλίωση συμβάλλει στον σχηματισμό οστού. Κείμενο: Η οικογένεια πρωτεϊνών διαμεμβρανικής πρωτεΐνης που προκαλείται από ιντερφερόνη (IFITM) (γνωστή και ως οικογένεια Fragilis σε ποντίκια) είναι μέρος της οικογένειας dispanin [1] και αποτελείται από διπλά -διαμεμβρανικές α-έλικες συνδεδεμένες με έναν κυτταροπλασματικό (CP) βρόχο και εξωκυτταρικές (EC) αμινο-και καρβοξυτελικές πολυπεπτιδικές αλληλουχίες (Εικόνα 1-Α). Οι πρωτεΐνες IFITM διατηρούνται εξελικτικά στα σπονδυλωτά [2] . Πρόσφατη γονιδιωματική έρευνα αποκάλυψε ότι υπάρχουν 5 μέλη IFITM στους ανθρώπους (IFITM1, 2, 3, 5 και 10) και 7 μέλη σε ποντίκια (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7 και 10). Αυτές οι πρωτεΐνες παίζουν ρόλο σε διάφορες βιολογικές διεργασίες, όπως η ωρίμανση των γεννητικών κυττάρων κατά τη γαστρίωση (IFITM1-3) [3] [4] [5] , η προσκόλληση κυττάρου σε κύτταρο (IFITM1) [6] [7] [8] , αντιική δράση (IFITM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] , και σχηματισμός οστού (IFITM5) [18] [19] [20] [21] [22] , αν και οι λεπτομερείς λειτουργίες των IFITM6, 7 και 10 είναι άγνωστες προς το παρόν. Συγκεκριμένα, το IFITM3 έχει αποτελέσει στόχο εντατικών μελετών σχετικά με τη δραστηριότητά του κατά της μόλυνσης και της εσωτερίκευσης του ιού της γρίπης Α (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14] .Το 2010, ο Δρ. Yount και οι συνάδελφοι ανέφεραν ότι η αντιική δράση του IFITM3 εξαρτάται από την S-παλμιτοϋλίωση στην πρωτεΐνη [10] . Η S-παλμιτοϋλίωση [23] είναι μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση πρωτεϊνών από κορεσμένα λιπαρά οξέα C 16 (παλμιτικά οξέα) ομοιοπολικά συνδεδεμένα με ορισμένα υπολείμματα κυστεΐνης μέσω μιας θειοεστερικής σύνδεσης (Εικόνα 1-Β). Η τροποποίηση καταλύεται αναστρέψιμα από πρωτεϊνικές ακυλοτρανσφεράσες και ακυλοπρωτεϊνικές θειοεστεράσες και προσδίδει μοναδικές ιδιότητες στην πρωτεΐνη, όπως σύνδεση και στόχευση μεμβράνης, ανοσοαντιδραστικότητα, ευθυγράμμιση αλληλουχίας αμινοξέων των IFITM5, IFITM1, IFITM2 και IFITM3 που προέρχονται από ποντίκια. Τα διατηρημένα υπολείμματα επισημαίνονται με μαύρο χρώμα. Οι τρεις διατηρημένες κυστεΐνες επισημαίνονται με κόκκινο και αριθμούνται με βάση την αλληλουχία των IFITM5 (πάνω) και IFITM3 (κάτω). Τα υπολείμματα μοναδικά στο IFITM5 επισημαίνονται με γκρι χρώμα. Η πρώτη και η δεύτερη διαμεμβρανική περιοχή, οι εξωκυτταρικές αλληλουχίες και ο κυτταροπλασματικός βρόχος υποδεικνύονται με βέλη και συμβολίζονται ως ΤΜ1 και ΤΜ2, EC και κρίκος CP, αντίστοιχα. Οι τομείς TM προβλέφθηκαν από το SOSUI. Τα ασπαρτικά στην C-τερματική περιοχή στο IFITM5 εμφανίζονται με μπλε χρώμα. Β) Η σχηματική απεικόνιση της πρωτεΐνης S-παλμιτοϋλίωσης. Το C16-παλμιτικό οξύ συνδέεται με την κυστεΐνη μέσω ενός δεσμού θειοεστέρα. Η παλμιτοϋλίωση και η αποπαλμιτουλίωση καταλύονται από πρωτεϊνικές ακυλοτρανσφεράσες και ακυλοπρωτεϊνικές θειοεστεράσες, αντίστοιχα. Σε αυτή τη μελέτη, η υδροξυλαμίνη, NH 2 OH, χρησιμοποιήθηκε για τη μείωση της σύνδεσης θειοεστέρα. Γ) Συνοψίζεται η ταυτότητα (ομοιότητα) της αλληλουχίας αμινοξέων μεταξύ των IFITM5, IFITM1, IFITM2 και IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 και αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Οι συγγραφείς αποκάλυψαν ότι το IFITM3 είναι S-παλμιτοϋλιωμένο σε τρεις εγγύς κυστεΐνες μεμβράνης, Cys71 και Cys72 στην πρώτη διαμεμβρανική περιοχή (TM1) και Cys105 στον βρόχο CP (Εικόνα 1-Α) [10] . Επιπλέον, το IFITM3 που δεν έχει την S-παλμιτοϋλίωση δεν συγκεντρώνεται στην κυτταρική μεμβράνη και μειώνει σημαντικά την αντιική δράση. Επιπλέον, οι κυστεΐνες στα IFITM2, Cys70, Cys71 και Cys104 επίσης παλμιτοϋλιώνονται με τον ίδιο τρόπο, γεγονός που επηρεάζει τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό [24] . Μια πρόσφατη μελέτη αποκάλυψε ότι το IFITM1 ποντικού έχει τέσσερα υπολείμματα κυστεΐνης (Cys49, Cys50, Cys83 και Cys103) για την S-παλμιτουλίωση, η οποία απαιτείται για την αντιική δράση και τη σταθερότητα της πρωτεΐνης [25] . Τα άλλα μέλη της οικογένειας IFITM διαθέτουν επίσης αυτές τις κυστεΐνες (Εικόνα 1-Α) , και επομένως ο ρόλος της σπαλμιτοϋλίωσης στις κυστεΐνες θα πρέπει να είναι σημαντικός για τις λειτουργίες των πρωτεϊνών IFITM. Εδώ, επικεντρωθήκαμε στο IFITM5, το οποίο είναι επίσης γνωστό ως περιορισμένο IFITM πρωτεΐνη τύπου (BRIL) [18] . Μεταξύ των πρωτεϊνών της οικογένειας IFITM, το IFITM5 είναι μοναδικό. (i) Έκφραση του IFITM5: Σε αντίθεση με τις άλλες πρωτεΐνες της οικογένειας IFITM, η έκφραση του IFITM5 δεν προκαλείται από ιντερφερόνες επειδή η περιοχή ανάντη του γονιδίου ifitm5 στερείται των ρυθμιστικών στοιχείων της ιντερφερόνης [26] . Επιπλέον, η έκφραση του IFITM5 περιορίζεται κυρίως στα κύτταρα οστεοβλαστών [18, 19, 27], ενώ οι άλλες πρωτεΐνες IFITM εκφράζονται παντού (ii). Ομοιότητα αλληλουχίας αμινοξέων: Η αλληλουχία αμινοξέων του IFITM5 είναι σχετικά ανόμοια με τις πρωτεΐνες IFITM1-3 (~ 65% ομοιότητα), ενώ οι πρωτεΐνες IFITM1-3 μοιράζονται ~ 85% ομοιότητα μεταξύ τους (Εικόνα 1 -C). Επιπλέον, το IFITM5 έχει μια περιοχή πλούσια σε ασπαρτικό στην C-τερματική περιοχή, η οποία θα μπορούσε να εμπλέκεται στη δέσμευση ασβεστίου (Εικόνα 1 -Α) [26] . (iii) Ο ρόλος του IFITM5 στον σχηματισμό οστών: Η έκφραση του IFITM5 σχετίζεται με την ανοργανοποίηση κατά τη διαδικασία σχηματισμού οστού σε κύτταρα οστεοβλαστών [18] [19] [20] [21] . Προηγούμενες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει την έκφραση του IFITM5 σε οστικούς ιστούς σε ποντίκια, αρουραίους, ανθρώπους και ταμάρια wallabies [2] . Τα ποντίκια νοκ-άουτ του γονιδίου ifitm5 έχουν μικρότερα οστά [19] . Επιπλέον, η καταστροφή του γονιδίου ifitm5 από το μικρό RNA της φουρκέτας προκαλεί μείωση στο σχηματισμό οζιδίων οστού, ενώ η υπερέκφραση του γονιδίου στα κύτταρα UMR106 έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει την πρόσληψη ασβεστίου και τον σχηματισμό οστικών οστών [18] . (iv) Ο ρόλος του IFITM5 για την ανοσολογική δραστηριότητα: Πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν ότι το IFITM5 αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη 11 που δεσμεύει το FK506 (FKBP11) για να σχηματίσει το σύμπλεγμα IFITM5-FKBP11-CD81-το σύμπλεγμα αρνητικού ρυθμιστή του υποδοχέα F2 προσταγλανδίνης (FPRP) [28]. Όταν σχηματίζεται το σύμπλεγμα, επάγονται οι εκφράσεις 5 γονιδίων που προκαλούνται από ιντερφερόνη, συμπεριλαμβανομένου του αντιγόνου 2 στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών (Bst2), της επαγόμενης από ιντερφερόνη πρωτεΐνης 1 (Irgm), της πρωτεΐνης που προκαλείται από ιντερφερόνη με επαναλήψεις τετρατρικοπεπτιδίου 3 (Ifit3), b(2) μικροσφαιρίνη (B2m) και γονίδιο αντιγόνου MHC τάξης Ι. Συνεπώς, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το IFITM5 εμπλέκεται όχι μόνο στον σχηματισμό οστών αλλά και στη δραστηριότητα του ανοσοποιητικού συστήματος. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την S-παλμιτουλίωση του IFITM5 και τον ρόλο του στην αλληλεπίδραση με το FKBP11 σε κύτταρα οστεοβλαστών ποντικού. Κύτταρα που επιμολύνθηκαν από ένα πλασμιδικό DNA που κωδικοποιεί IFITM5 ποντικού αναπτύχθηκαν παρουσία ενός καθιερωμένου χημικού ανταποκριτή, του 17-οκταδεκυνοϊκού οξέος (17-ODYA) [29, 30] ή ενός αναστολέα για την S-παλμιτουλίωση, 2-βρωμοπαλμιτικού οξέος (2BP ) [31] . Οι βιοχημικές δοκιμασίες που χρησιμοποιούν αυτές τις ενώσεις αποκάλυψαν ότι το άγριου τύπου IFITM5 είναι S-παλμιτοϋλιωμένο. Για να ταυτοποιήσουμε τη θέση σπαλμιτοϋλίωσης στο IFITM5, παρασκευάσαμε μεταλλάγματα υποκατεστημένα με κυστεΐνη, IFITM5-C86A, -C52A/C53A και -C52A/53A/86A (Cys-less). Η ανάλυση χημικού ανταποκριτή πρότεινε ότι τουλάχιστον δύο στις τρεις κυστεΐνες στο IFITM5 είναι S-παλμιτοϋλιωμένες. Η αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11 εξετάστηκε με δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης, με αποτέλεσμα την απώλεια της αλληλεπίδρασης παρουσία 2ΒΡ. Το ίδιο αποτέλεσμα λήφθηκε στους δύο μεταλλάκτες, C52A/C53A και Cys-less. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η S-παλμιτοϋλίωση σε Cys52 και/ή Cys53 στον τομέα ΤΜ1 του IFITM5 είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση με το FKBP11. Από την άλλη πλευρά, το Cys86 στον βρόχο CP του IFITM5 ήταν S-παλμιτοϋλιωμένο αλλά δεν συμμετείχε στην αλληλεπίδραση. Επειδή αυτή η αλληλεπίδραση είναι σημαντική για την ανοσολογικά σχετική έκφραση γονιδίου, υποδείχθηκε ότι ο ρόλος της S-παλμιτοϋλίωσης είναι να προάγει την αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11 και να ρυθμίζει την ανοσολογική δραστηριότητα στα κύτταρα οστεοβλαστών. Ο πιθανός μηχανισμός αλληλεπίδρασης και η επίδραση της S-παλμιτοϋλίωσης στον σχηματισμό όζων οστού θα συζητηθούν. Για την έκφραση των κυττάρων θηλαστικών, κατασκευάστηκαν πλασμιδικοί φορείς άγριου τύπου IFITM5 (IFITM5-WT) και συντηγμένου με FLAG FKBP11 (FKBP11-FLAG). με εισαγωγή των κλωνοποιημένων γονιδίων σε φορέα έκφρασης pBApo-CMV Neo (Takara Bio, Shiga, Japan). Οι λεπτομέρειες των κατασκευών ανασυνδυασμένου DNA ήταν οι ίδιες με αυτές που περιγράφηκαν προηγουμένως [19] . Τα γονίδια των μεταλλαγμάτων IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, και -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ μεταλλαξογένεσης κατευθυνόμενης θέσης QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA). Οι φορείς πλασμιδίου των συντηγμένων με FLAG IFITM5-WT, -C52A/53A και Cys-less κατασκευάστηκαν με εισαγωγή των κλωνοποιημένων γονιδίων στον φορέα έκφρασης pBApo-CMV Neo. Για έκφραση κυττάρων Ε. coli, ο πλασμιδιακός φορέας του IFITM5-WT κατασκευάστηκε με εισαγωγή του κλωνοποιημένου γονιδίου σε φορέα έκφρασης pET22b (Novagen, Madison, WI). Ο εμπρόσθιος εκκινητής 5'-GGAATTCCATATGGACACTTCATATCCCCGTG-3' και ο αντίστροφος εκκινητής 5'-CCGCTCGAGGTTATAGTCCTCCTCATCAAACTTGG-3' χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του γονιδίου που κωδικοποιεί ολόκληρο το IFITM5 από τον φορέα πλασμιδίου για έκφραση κυττάρου θηλαστικού. Τα υπογραμμισμένα γράμματα δηλώνουν μια θέση διάσπασης NdeI και XhoI, αντίστοιχα. Τα πλασμίδια των μεταλλαγμάτων IFITM5 παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ μεταλλαξογένεσης κατευθυνόμενης θέσης QuikChange. Οι εκκινητές με νόημα και αντί-νοηματοδότηση που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5'-GGCAGTATGGCTCCAAAGCCAAGGCGTACAACATCCTGG CTGC-3' και 5'-GCAGCCAGGATGTTGTACGCCTTGGCTTTGGAGCATACT GCC-3' για IFITM5-C86A. και 5'-GCACGATGTACCTGAATCTGGCGGCGCTTTGGATTCCTGG CGC-3' και 5'-GCGCCAGGAATCCAAGCGCCGCCAGATTCAGGTACATCG TGC-3' για τα IFITM5-C52A/C53A, αντίστοιχα, παρέχονταν από τα κύτταρα που μοιάζουν με τα Cee-ΙΙΙΜΟΑ, τα Louise-3Richtllma. Τράπεζα (RCB 1126). Οι διαδικασίες για κυτταρική καλλιέργεια, επιμόλυνση και έκφραση πρωτεΐνης ήταν οι ίδιες με αυτές που αναφέρθηκαν προηγουμένως. Όταν είναι απαραίτητο, 2-βρωμοπαλμιτικό οξύ (2BP; Wako, Osaka, Ιαπωνία) και 17-οκταδεκυνοϊκό οξύ (17-ODYA; Sigma-Aldrich) διαλύθηκαν σε 99,5% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO; Wako) και προστέθηκαν στο μέσο διαφοροποίησης σε συγκεντρώσεις 100 μΜ και 50 μΜ σε λιγότερο από 0,1% DMSO, αντίστοιχα [30, 31] . Οι πρωτεΐνες άγριου τύπου και μεταλλαγμένες IFITM5 παρήχθησαν επίσης χρησιμοποιώντας ένα ανασυνδυασμένο σύστημα έκφρασης E. coli. Κύτταρα E. coli BL21(DE3) που μετασχηματίστηκαν από το πλασμίδιο έκφρασης αναπτύχθηκαν στους 37°C σε μέσο LB που περιείχε 50 μg/mL αμπικιλλίνη. Μετά από τετράωρη επαγωγή από 1 mM ισοπροπυλ β-Δθειογαλακτοπυρανοσίδη (IPTG), τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (6.400 χ g για 10 λεπτά στους 4°C). Τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl 50 mM (ρΗ 8) και διασπάστηκαν με γαλλική πρέσα (Ohtake, Τόκιο, Ιαπωνία) (100 MPa χ 4 φορές). Το ακατέργαστο κλάσμα μεμβράνης συλλέχθηκε με υπερφυγοκέντρηση (178.000 χ g για 90 λεπτά στους 4°C). Το συλλεχθέν κλάσμα διαλυτοποιήθηκε με 1,5% η-δωδεκυλ-β-Δμαλτοπυρανοσίδη (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Ιαπωνία) σε 50 mM Tris-HCl, ρΗ 8, που περιέχει 0,3 Μ NaCl και 5 mM ιμιδαζόλη. Μετά την υπερφυγοκέντρηση, το υπερκείμενο επωάστηκε με ρητίνη αγαρόζης Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Γερμανία). Η ρητίνη εφαρμόστηκε σε στήλη χρωματογραφίας και πλύθηκε με 50 mM ιμιδαζόλης που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 8), 0,3 Μ NaCI και 0,1% DDM. Το διαλυτοποιημένο με DDM IFITM5 συλλέχθηκε με έκλουση με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0,3 Μ ιμιδαζόλη. Τα μέσα δείγματος αντικαταστάθηκαν από το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα με δύο διελεύσεις πάνω από μια στήλη PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Αγγλία). Οι πειραματικές λεπτομέρειες περιγράφονται σε προηγούμενες αναφορές [19, 28]. Εν συντομία, ολικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από τα κύτταρα οστεοβλαστών που συνέκφρασαν IFITM5 και FKBP11-FLAG χρησιμοποιώντας ένα κιτ εξαγωγής ολικής πρωτεΐνης (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Στη συνέχεια, το κυτταρόλυμα επωάστηκε με αντι-FLAG M2 πήκτωμα αγαρόζης (Sigma-Aldrich) στους 4°C για 2 ώρες. Για την ανάκτηση του FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × FLAG πεπτίδιο (Sigma-Aldrich) διαλυμένο σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με Tris προστέθηκαν στο συλλεγμένο πήκτωμα στους 4°C για 1 ώρα. Οι ανακτημένες πρωτεΐνες και το κυτταρόλυμα που περιέχει ολικές πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Τόκιο, Ιαπωνία) και western blot. Το πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-IFITM5, το οποίο παρασκευάστηκε από την αμινοτελική πεπτιδική αλληλουχία (TSYPREDPRAPSSRC), και το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-FLAG (Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτεύοντα αντισώματα. Τα συζευγμένα με HRP αντισώματα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (H+L) (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) και αντισώματα κατσίκας αντι-ποντικού IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκαν ως δευτερεύοντα αντισώματα για το αντι-IFITM5 και αντι-FLAG πρωτογενή αντισώματα, αντίστοιχα. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με αντίδραση χημειοφωταύγειας (MercK-Millipore, Billerica, ΜΑ). Το κυτταρόλυμα που εκχυλίστηκε από τα κύτταρα οστεοβλαστών που ήταν μεταβολικά σημασμένα από 17-ODYA επωάστηκε με γέλη αγαρόζης anti-FLAG M2 για να ληφθούν καθαρισμένες πρωτεΐνες IFITM5 συντηγμένες με FLAG. Οι σημασμένες με 17-ΟΔΥΑ πρωτεΐνες επισημάνθηκαν χημικά με αζίδιο-PEG3-5(6)-καρβοξυτετραμεθυλροδαμίνη (ΤΑΜΡΑ-αζίδιο; Κάντε κλικ στο Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) με αναφορά σε προηγούμενες μελέτες [10, 29, 30, 32] και στον οδηγό του κατασκευαστή. Οι πρωτεΐνες που διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λέιζερ 532 nm για διέγερση και ο φθορισμός με TAMRA (565 nm) ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας φίλτρο μακράς διαδρομής 575 nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Τα υποκαλλιεργημένα κύτταρα οστεοβλαστών MC3T3 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5.000 κυττάρων/cm2 σε δίσκους 40 mm και καλλιεργήθηκαν σε α-Τροποποιημένο Μέσο Eagle (α-ΜΕΜ; Sigma-Aldrich) που περιέχει 10% (v/v) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Τόκιο, Ιαπωνία). Την επόμενη μέρα, αυτό αντικαταστάθηκε με μέσο διαφοροποίησης, που περιείχε 2 mM γλυκεροφωσφορικό και 50 μg/mL ασκορβικό νάτριο σε τελικές συγκεντρώσεις, για να προκληθεί διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. Όταν ήταν απαραίτητο, 100 μM 2BP σε λιγότερο από 0,1% DMSO ή 0,1% DMSO μόνο προστέθηκαν στο μέσο διαφοροποίησης σε τελικές συγκεντρώσεις. Όλες οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 37°C σε υγρή ατμόσφαιρα που περιείχε 5% CO2 για 27 ημέρες. Τα μεταλλαγμένα οζίδια χρωματίστηκαν με Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Χρησιμοποιήθηκε η τυπική διαδικασία χρώσης. Οι ανοργανοποιημένοι όζοι ελέγχονταν κάθε τρεις ημέρες. Για την αναγνώριση της S-παλμιτουλίωσης στο IFITM5, τα κύτταρα οστεοβλαστών που έφεραν το πλασμιδικό DNA που κωδικοποιεί το IFITM5-WT καλλιεργήθηκαν απουσία και παρουσία 2BP, η οποία αναστέλλει την S-παλμιτουλίωση (Εικόνα 2-Α ) [31] . Στη συνέχεια, το κυτταρόλυμα που περιείχε ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε για χρήση στις αναλύσεις SDS-PAGE και western blot. Για λόγους σύγκρισης, τα κύτταρα Ε. coli καλλιεργήθηκαν επίσης απουσία 2ΒΡ και το κυτταρόλυμα εκχυλίστηκε. Το Σχήμα 2 -Β δείχνει τα αποτελέσματα της δοκιμασίας κηλίδος western για το IFITM5-WT που εκφράζεται στον οστεοβλάστη και στα κύτταρα Ε. coli. Στα κύτταρα οστεοβλαστών, το IFITM5-WT εμφάνισε μια μονή ζώνη κοντά στον δείκτη μοριακής μάζας 17,4 kDa (βλ. λωρίδα 1) απουσία 2BP. Ωστόσο, παρουσία 2BP (βλ. λωρίδα 4), η ζώνη εμφανίστηκε σε χαμηλότερη θέση από αυτήν απουσία 2BP (λωρίδα 1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το IFITM5-WT έχει μορφές υψηλής και χαμηλής μοριακής μάζας απουσία και παρουσία 2BP, αντίστοιχα. Η S-παλμιτοϋλίωση είναι μια αναστρέψιμη αντίδραση και επομένως αποπαλμιτοϋλιώνεται από ένα ισχυρό αναγωγικό όπως η υδροξυλαμίνη [10] . Μετά την επεξεργασία με υδροξυλαμίνη (βλ. λωρίδα 2), η ταινία εμφανίστηκε στην ίδια θέση όπως παρουσία 2ΒΡ (λωρίδα 4). Σε προκαρυωτικά κύτταρα E. coli, η μετα-μεταφραστική τροποποίηση S-Palmitoylation στο IFITM5 PLOS ONE \| Το www.plosone.org δεν εμφανίζεται. Ως εκ τούτου, η ζώνη παρατηρήθηκε επίσης στην ίδια χαμηλότερη θέση (βλ. λωρίδα 3). Στην περίπτωση του IFITM3, η παλμιτοϋλίωση αναφέρθηκε επίσης ότι επάγει μια αλλαγή στην κινητικότητα κατά την ηλεκτροφόρηση, όπως και στα σημερινά μας αποτελέσματα [10] . Για άμεση παρατήρηση της S-παλμιτοϋλίωσης, ένας καθιερωμένος χημικός ανταποκριτής, 17-ODYA (Εικόνα 2 -Γ) , χρησιμοποιήθηκε. Τα κύτταρα οστεοβλαστών που φέρουν το πλασμίδιο που κωδικοποιεί IFITM5-WT καλλιεργήθηκαν παρουσία 17-ODYA για να επισημανθεί η πρωτεΐνη μεταβολικά. Μετά την εκχύλιση και τον καθαρισμό του κυτταρολύματος, το σημασμένο IFITM5-WT συνδέθηκε με αζίδιο TAMRA σύμφωνα με τη μέθοδο κυκλοπροσθήκης [3+2] αζιδαλκινίου που καταλύθηκε με Cu(I) [10, 29, 30, 32]. Μια εικόνα φθορισμού σε πήκτωμα του σημασμένου με 17-ODYA-TAMRA IFITM5-WT (βλ. λωρίδα 2 στο Σχήμα 2-D) έδειξε ότι το IFITM5 ήταν Σπαλμιτοϋλιωμένο στα κύτταρα οστεοβλαστών. Η ετικέτα FLAG που είναι προσαρτημένη στο IFITM5 δεν επηρεάζει την τροποποίηση και τη χημική επισήμανση (λωρίδες 1 και 5). Επιπλέον, μετά την επεξεργασία με υδροξυλαμίνη (βλ. λωρίδα 6), ο φθορισμός έγινε αδύναμος λόγω της διάστασης της 17-ODYA από το IFITM5, που ήταν ο ίδιος μηχανισμός με τη διάσταση του παλμιτικού οξέος από το IFITM5 με αναγωγή όπως περιγράφεται παραπάνω (λωρίδα 2 του Σχήματος 2-Β). Συνεπώς, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το IFITM5 που εκφράζεται στα φυσικά κύτταρα οστεοβλαστών είναι S-παλμιτοϋλιωμένο. Επιπλέον, οι ζώνες που αντιστοιχούν στις μορφές υψηλής και χαμηλής μοριακής μάζας που φαίνονται στην ανάλυση western blot αποδίδονται δοκιμαστικά στις S-παλμιτοϋλιωμένες και στις αποπαλμιτοϋλιωμένες μορφές, αντίστοιχα. Όπως περιγράφεται παραπάνω στην Εισαγωγή, τα υπολείμματα κυστεΐνης είναι το υπόστρωμα για το S -παλμιτοϋλίωση. Το IFITM5 διαθέτει τρεις κυστεΐνες, Cys52 και Cys53 στον τομέα ΤΜ1 και Cys86 στον βρόχο CP (Εικόνα 1-Α). Όλες αυτές οι κυστεΐνες είναι εξαιρετικά συντηρημένες μεταξύ των πρωτεϊνών της οικογένειας IFITM θηλαστικών (Εικόνα 3-Α). Για να ταυτοποιήσουμε τη θέση τροποποίησης στο IFITM5, παρασκευάσαμε μεταλλάγματα υποκατεστημένα με κυστεΐνη, IFITM5-C52A/C53A, -C86A και -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Τα κύτταρα οστεοβλαστών που φιλοξενούν κάθε πλασμίδιο καλλιεργήθηκαν απουσία 2ΒΡ, και στη συνέχεια το κυτταρόλυμα εκχυλίστηκε. Το Σχήμα 3-Β δείχνει τα αποτελέσματα του στυπώματος western που ανιχνεύει την έκφραση όλων των μεταλλάξεων στα κύτταρα οστεοβλαστών. Στα μεταλλαγμένα C52A/C53A και Cys-less (βλέπε λωρίδες 2 και 4), ανιχνεύθηκε η μορφή χαμηλής μοριακής μάζας. Αυτό το αποτέλεσμα υποδεικνύει ότι είτε το Cys52 είτε το Cys53 εμπλέκεται στη S-παλμιτοϋλίωση. Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2 -Δ, ισχυρός και ασθενής φθορισμός ανιχνεύθηκαν στο μετάλλαγμα C52A/C53A απουσία και παρουσία υδροξυλαμίνης (λωρίδες 3 και 7), αντίστοιχα, αλλά όχι στο μετάλλαγμα Cys-less (λωρίδες 4 και 8). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η υπόλοιπη κυστεΐνη στο μετάλλαγμα C52A/C53A, Cys86, είναι S-παλμιτοϋλιωμένη και η μετάλλαξη χωρίς Cys έχασε εντελώς τη S-παλμιτουλίωση επειδή όλες οι κυστεΐνες υποκαταστάθηκαν. Επομένως, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το Cys86, συν ένα ή δύο άλλα υπολείμματα κυστεΐνης στο IFITM5, δηλ. Cys52 και/ή Cys53, είναι S-παλμιτοϋλιωμένα. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η S-παλμιτοϋλίωση στην περιοχή ΤΜ1 έχει σημαντική επίδραση στην κινητικότητα στο πήκτωμα (κάτω πλαίσιο του Σχήματος 2-D και του Σχήματος 3-Β). Ως εκ τούτου, στο εξής αναφερόμαστε στις μορφές υψηλής και χαμηλής μοριακής μάζας ως ΤΜ1-παλμιτοϋλιωμένη και ΤΜ1-απαλμιτοϋλιωμένη μορφή, αντίστοιχα. Τέλος, επαναπροσδιορίσαμε τις ζώνες που εμφανίζονται στην ανάλυση western blot ως εξής: το IFITM5-WT είναι πλήρως παλμιτοϋλιωμένο, το μετάλλαγμα C86A είναι μερικώς παλμιτοϋλιωμένο σε Cys52 και/ή Cys53, το μετάλλαγμα C52A/C53A είναι μερικώς παλμιτοϋλιωμένο στο Cys8 λιγότερο μεταλλαγμένο είναι πλήρως αποπαλμιτοϋλιωμένο. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι το IFITM5 αλληλεπιδρά με το FKBP11 [19] . Η FKBP11 ανήκει στην οικογένεια πρωτεϊνών που δεσμεύουν FK506 και έχει διαμεμβρανική περιοχή. Η αλληλεπίδραση μεταξύ IFITM5 και FKBP11 είναι σημαντική για την ανοσολογική δραστηριότητα επειδή ο σχηματισμός του συμπλέγματος IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP επάγει την έκφραση των επαγόμενων από ιντερφερόνη γονιδίων και συγκεκριμένα του γονιδίου αντιγόνου Bst2, Irgm, Ifit3, B2m και MHC [28. ] . Για να διερευνήσουμε την επίδραση της S-παλμιτοϋλίωσης στην αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης. Τα κύτταρα οστεοβλαστών που συνεπιμολύνθηκαν από τα πλασμίδια που κωδικοποιούν IFITM5-WT και FKBP11-FLAG καλλιεργήθηκαν απουσία και παρουσία 2ΒΡ. Στη συνέχεια, το εκχυλισμένο κυτταρόλυμα επωάστηκε με αντι-FLAG γέλη αγαρόζης. Το πήκτωμα πλύθηκε πολλές φορές. Τέλος, οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν ανταγωνιστικά με την προσθήκη πεπτιδίου FLAG. Εάν το IFITM5 αλληλεπιδρούσε με το FKBP11, αναμενόταν ότι το IFITM5 Οι διατηρημένες κυστεΐνες επισημαίνονται με πορτοκαλί χρώμα και αριθμούνται. Στο κάτω πλαίσιο, οι αριθμοί που δίνονται σε παρένθεση αντιστοιχούν στον υπολειπόμενο αριθμό για το IFITM2. Για τον υπολογισμό της πιθανότητας χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 23 αλληλουχίες IFITM2, 23 IFITM3 και 17 IFITM5 που προέρχονται από είδη θηλαστικών στη βάση δεδομένων Εγκυκλοπαίδεια Γονιδίων και Γονιδιωμάτων του Κιότο (KEGG). Η ευθυγράμμιση της αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας CLUSTALW. Τα λογότυπα ακολουθιών δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το WEBLOGO 3. Β) Κηλίδα Western για τα μεταλλάγματα άγριου τύπου και υποκατεστημένα με κυστεΐνη του IFITM5 που εκφράζονται στα κύτταρα οστεοβλαστών. Για ανίχνευση, το αντίσωμα αντι-IFITM5 χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεύον αντίσωμα. Το επάνω βέλος υποδεικνύει ότι το C52 και/ή το C53 στην περιοχή ΤΜ1 είναι Σπαλμιτοϋλιωμένο (λωρίδες 1 και 3). Τα μεταλλάγματα C52A/C53A (λωρίδα 2) και Cys-less (λωρίδα 4) είναι μερικώς και πλήρως αποπαλμιτοϋλιωμένα. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε 2 φορές. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 θα ληφθεί κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου και θα ανιχνευθεί με ανοσοστύπωση. Το Σχήμα 4 -Α δείχνει τα αποτελέσματα του στυπώματος western για την συν-ανοσοκαθίζηση του IFITM5-WT με FKBP-FLAG. Η ζώνη που αντιστοιχεί στο FKBP11 εμφανίστηκε σε όλες τις λωρίδες (άνω πίνακα). Οι λωρίδες 1 και 2 είναι έλεγχοι για να διασφαλιστεί ότι τα IFITM5 και FKBP11 περιέχονται και τα δύο στο κυτταρόλυμα πριν από την ανοσοκατακρήμνιση. Οι έλεγχοι εξασφάλισαν επίσης ότι το IFITM5 ήταν S-παλμιτοϋλιωμένο απουσία 2ΒΡ (βλ. λωρίδα 1), ενώ το IFITM5 δεν ήταν S-παλμιτοϋλιωμένο παρουσία 2ΒΡ (βλ. λωρίδα 2). Μετά την ανοσοκατακρήμνιση, εμφανίστηκε μια μονή ζώνη που αντιστοιχεί στο S-παλμιτοϋλιωμένο IFITM5 απουσία 2ΒΡ (βλ. λωρίδα 3), υποδεικνύοντας την αλληλεπίδραση του σπαλμιτοϋλιωμένου IFITM5 με το FKBP11. Ωστόσο, παρουσία 2BP, δεν εμφανίστηκε ζώνη που να αντιστοιχεί στο IFITM5 (βλ. λωρίδα 4), υποδεικνύοντας ότι τα δύο μόρια δεν αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 συμβάλλει στην αλληλεπίδραση με το FKBP11. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ της σπαλμιτοϋλίωσης και της αλληλεπίδρασης με το FKBP11 χρησιμοποιώντας τα μεταλλάγματα IFITM5 που περιγράφονται παραπάνω. Τα οστεοβλαστικά κύτταρα που συνεπιμολύνθηκαν από τα πλασμίδια που κωδικοποιούν μεταλλάκτες IFITM5 (C52A/C53A, C86A και Cys-less) και FKBP11-FLAG καλλιεργήθηκαν. Η δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης διεξήχθη με τον ίδιο τρόπο όπως περιγράφηκε παραπάνω. Το Σχήμα 4-Β δείχνει τα αποτελέσματα του στυπώματος western για την συν-ανοσοκαθίζηση των μεταλλαγμάτων άγριου τύπου και IFITM5 με FKBP11. Το Σχήμα 4 -Γ δείχνει τα αποτελέσματα του πειράματος ελέγχου χρησιμοποιώντας το κυτταρόλυμα πριν από την ανοσοκαταβύθιση. Όπως περιγράφηκε στην προηγούμενη ενότητα 3-3, η ζώνη που αντιστοιχεί στο FKBP11 εμφανίστηκε σε όλες τις λωρίδες (άνω πάνελ) επειδή η ανοσοκατακρήμνιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το πήκτωμα αγαρόζης αντι-FLAG. Στο κάτω πλαίσιο του Σχήματος 4-Β, παρατηρήθηκαν μονές ζώνες για το μετάλλαγμα IFITM5-WT και -C86A (λωρίδες 1 και 3) αλλά όχι για τα μεταλλάγματα -C52A/C53A και Cys-less (λωρίδες 2 και 4). Αυτό το αποτέλεσμα υποδεικνύει ότι η άγριου τύπου μετάλλαξη και η μετάλλαξη C86A αλληλεπιδρούν με το FKBP11, ενώ οι άλλοι δύο μεταλλάκτες όχι. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτή η τάση αντικατοπτρίζει την τάση για τα προφίλ S-παλμιτοϋλίωσης, πράγμα που σημαίνει ότι τα Cys52 και/ή Cys53 στον τομέα TM1 των μεταλλαγμάτων IFITM5-WT και -C86A είναι S-παλμιτοϋλιωμένα, ενώ αυτά τα υπολείμματα δεν είναι S-παλμιτοϋλιωμένα στο C52A/C53A και μεταλλαγμένα χωρίς Cys (βλ. Σχήματα 2-D, 3-B και το κάτω πλαίσιο του Σχήματος 4 -C). Επειδή η S-παλμιτοϋλίωση συμβάλλει στην αλληλεπίδραση IFITM5-FKBP11, όπως περιγράφεται στην προηγούμενη ενότητα 3-3 (επίσης στο Σχήμα 4-Α), τα αποτελέσματα του Σχήματος 4-Β υποδηλώνουν ότι τα μεταλλάγματα που έχασαν τη θέση S-παλμιτοϋλίωσης ( s), Cys52 και/ή Cys53, δεν μπορούν να αλληλεπιδράσουν με το FKBP11. Με άλλα λόγια, η S-παλμιτοϋλίωση σε αυτές τις κυστεΐνες είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11. Όπως περιγράφεται παραπάνω στην Εισαγωγή, προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι το IFITM5 συμβάλλει επίσης στον σχηματισμό οστού [18] [19] [20] [21] ] . Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την επίδραση της σπαλμιτοϋλίωσης στον σχηματισμό οζιδίων οστού σε κύτταρα οστεοβλαστών, στα οποία εκφράζεται το φυσικό IFITM5. Το Σχήμα 5 δείχνει τον εξαρτώμενο από το χρόνο σχηματισμό οζιδίων απουσία και παρουσία 2ΒΡ (Εικόνα 5-Α και -Β). Το Σχήμα 5 -Γ δείχνει τα αποτελέσματα της δοκιμής ελέγχου για την επαλήθευση της επίδρασης του DMSO, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως διαλύτης για το 2BP, στον σχηματισμό όζων. Το ανοργανοποιημένο οζίδιο χρωματίστηκε με Alizarin Red, το οποίο αντιδρά με το εναποτιθέμενο ασβέστιο. Στο Σχήμα 5 -Δ, η περιοχή του ανοργανοποιημένου οζιδίου σχεδιάστηκε σε συνάρτηση με τον πειραματικό χρόνο. Απουσία 2ΒΡ (Σχήμα 5-Α, -Γ και -Δ), η ανοργανοποίηση ξεκίνησε 15 ημέρες μετά την έναρξη της κυτταρικής διαφοροποίησης (Ημέρα 0). Από την άλλη πλευρά, παρουσία 2ΒΡ (Εικόνα 5-Β και -Δ), το οζίδιο σχηματίστηκε την Ημέρα 12. Το ημίχρονο για τη μέγιστη ανοργανοποίηση παρουσία 2BP εκτιμήθηκε ότι ήταν 7 ημέρες νωρίτερα από αυτό απουσία 2BP (Εικόνα 5-D). Επιπλέον, παρατηρήθηκαν διαφορές στη μορφή των μεταλλοποιημένων οζιδίων. Το Σχήμα 5 -Ε δείχνει μια μεγεθυμένη όψη κάθε όζου την Ημέρα 21. Τα χρωματισμένα οζίδια διαχέθηκαν παρουσία 2ΒΡ (πάνελ b), ενώ απουσία 2ΒΡ τα οζίδια σχημάτισαν ένα μεγάλο σύμπλεγμα (πάνελ α και γ). Ως εκ τούτου, οι παρατηρήσεις μας σε αυτή τη μελέτη πρότειναν ότι η S-παλμιτοϋλίωση επηρεάζει τον σχηματισμό οστικού οζιδίου στα κύτταρα οστεοβλαστών.Σε αυτή τη μελέτη, επιβεβαιώσαμε την S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 στα κύτταρα οστεοβλαστών, η οποία ήταν η ίδια με αυτή που αναφέρθηκε προηγουμένως για το IFITM3 και IFITM2. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, στα IFITM3 και IFITM2, τα οποία μοιράζονται 85% ομοιότητα αλληλουχίας (Εικόνα 1-C), δύο κυστεΐνες στον τομέα TM1 (Cys71 και Cys72 για IFITM3, Cys70 και Cys71 για IFITM2) και μία κυστεΐνη στον βρόχο CP (Cys10 για το IFITM3, το Cys104 για το IFITM2) είναι όλα S-παλμιτοϋλιωμένα σε κύτταρα [10, 24]. Από την άλλη πλευρά, αν και το IFITM5 μοιράζεται 68% και 66% ομοιότητα αλληλουχίας με τα IFITM3 και IFITM2, αντίστοιχα, περισσότερες από μία κυστεΐνες στον τομέα ΤΜ1 (Cys52 ή Cys53) και μία κυστεΐνη στον βρόχο CP (Cys86) είναι S-παλμιτοϋλιωμένες. Λαμβάνοντας υπόψη την υψηλή διατήρηση τριών κυστεϊνών στις πρωτεΐνες IFITM (Εικόνες 1-Α και 3-Α), όλες οι κυστεΐνες στο IFITM5 μπορεί να εμπλέκονται στην S-παλμιτοϋλίωση όπως ακριβώς στην περίπτωση των IFITM3 και IFITM2 [10, 24 ] .Οι ρόλοι της S-palmitoylation στο IFITM3 έχουν μελετηθεί εντατικά και η S-palmitoylation έχει αποδειχθεί ότι είναι κρίσιμος για τη σωστή τοποθέτηση στη μεμβράνη και την αντίσταση σε ιογενείς λοιμώξεις και εσωτερίκευση [10] (οι ρόλοι συνοψίζονται στο Σχήμα 6 -Α και συζητείται λεπτομερώς παρακάτω). Μια πρόσφατη μελέτη αποκάλυψε ότι η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM2 είναι επίσης σημαντική για τη συσσώρευση πρωτεϊνών στη μεμβράνη [24]. Ωστόσο, δεν γνωρίζουμε τον ρόλο της σπαλμιτοϋλίωσης του IFITM5 για τη συσσώρευση στη μεμβράνη προς το παρόν, επειδή δεν έχουμε καταφέρει ακόμη να αποκτήσουμε ένα κατάλληλο αντίσωμα για την ανοσοϊστοχημεία, παρά το γεγονός ότι αφιερώσαμε πολύ χρόνο στην αναζήτηση και λαμβάνοντας υπόψη έναν σημαντικό αριθμό αντισωμάτων .Δρ. Ο Hanagata και οι συνεργάτες του ανέφεραν προηγουμένως ότι το IFITM5 δεν είχε τον τομέα TM1 και τον βρόχο CP, ο οποίος και το IFITM5 (κάτω πάνελ), τα αντισώματα anti-FLAG και τα αντι-IFITM5 αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως κύρια αντισώματα, αντίστοιχα. Τα βέλη υποδεικνύουν την ύπαρξη κάθε πρωτεΐνης και την S-παλμιτουλίωση στο IFITM5. Α) Κηλίδα Western για την ταυτόχρονη ανοσοκατακρήμνιση του IFITM5 άγριου τύπου με το συντηγμένο με FLAG FKBP11 (FKBP11-FLAG) στα κύτταρα οστεοβλαστών απουσία και παρουσία 2ΒΡ (σημειώνεται ως \"-\" και \"+\", αντίστοιχα ). Οι λωρίδες 1 και 2 είναι τα αποτελέσματα για τις δοκιμές ελέγχου που χρησιμοποιούνται για την επαλήθευση της ύπαρξης IFITM5 και FKBP11 πριν από την ανοσοκατακρήμνιση και οι λωρίδες 3 και 4 δείχνουν τα αποτελέσματα μετά την ανοσοκατακρήμνιση. Το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές. Β) Κηλίδα Western για την συν-ανοσοκαθίζηση των μεταλλαγμάτων άγριου τύπου και των υποκατεστημένα με κυστεΐνη μεταλλάξεων του IFITM5 με FKBP11-FLAG στα κύτταρα οστεοβλαστών. Η ζώνη που αντιστοιχεί στο πεπτίδιο FLAG δεν φαίνεται λόγω της μικρότερης μοριακής μάζας του πεπτιδίου FLAG σε σχέση με το FKBP11-FLAG. Γ) Το πείραμα ελέγχου του Σχήματος 4-Β χρησιμοποιήθηκε για την επαλήθευση ότι τα IFITM5 και FKBP11 ήταν αμφότερα παρόντα στο κυτταρόλυμα πριν από την ανοσοκατακρήμνιση. Το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές. Α) Ο λειτουργικός μηχανισμός του IFITM3 συνοψίζεται από προηγούμενες μελέτες. (i) Το IFITM3 είναι S-παλμιτοϋλιωμένο στα Cys71, Cys72 και Cys105, (ii) το οποίο προκαλεί ομαδοποίηση και σωστή τοποθέτηση στη μεμβράνη, (iii) με αποτέλεσμα την αντιική δράση έναντι του ιού της γρίπης. Β) Ο λειτουργικός μηχανισμός του IFITM5 συνοψίζεται με το συνδυασμό των αποτελεσμάτων από την παρούσα και τις προηγούμενες μελέτες. (i) Το Cys86, συν ένα ή δύο άλλα υπολείμματα κυστεΐνης στο IFITM5, δηλ., Cys52 και/ή Cys53, είναι S-παλμιτοϋλιωμένα (ii). Η S-παλμιτοϋλίωση επιτρέπει στο IFITM5 να αλληλεπιδρά με το FKBP11 στα κύτταρα οστεοβλαστών (iii). Η διάσταση του CD9 από το σύμπλοκο FKBP11-CD81-FPRP/CD9 επάγεται από το σχηματισμό του συμπλόκου IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP και οδηγεί στην ανοσολογικά σχετική γονιδιακή έκφραση. Το IFITM5 συμβάλλει επίσης στον σχηματισμό οστού, αλλά είναι άγνωστο ποιες καταστάσεις όπως περιγράφονται στο (i)-(iii) είναι σημαντικές για τον σχηματισμό οστών επί του παρόντος. Προς το παρόν, δεν έχει εντοπιστεί αλληλεπιδραστική πρωτεΐνη στο IFITM3 και το IFITM2. Από την άλλη πλευρά, το IFITM5 αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη συνεργάτη, FKBP11, και η S-παλμιτοϋλίωση συμβάλλει σαφώς στην αλληλεπίδραση. Επομένως, το IFITM5 σχηματίζει ένα ετερο-ολιγομερές στην κυτταρική μεμβράνη για τη φυσιολογική του λειτουργία. περιέχει τις σχετικές θέσεις τροποποίησης, έχασε την ικανότητα αλληλεπίδρασης με το FKBP11 [19] . Στην παρούσα μελέτη, προσδιορίσαμε ότι η S-παλμιτοϋλίωση σε Cys52 και/ή Cys53 στον τομέα ΤΜ1 είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση. Από αυτά τα αποτελέσματα, υποθέτουμε ότι τα Cys52 και Cys53 βλέπουν προς την επιφάνεια αλληλεπίδρασης με το FKBP11 και επομένως τα IFITM5 και FKBP11 αλληλεπιδρούν μεταξύ τους μέσω του παλμιτικού οξέος που είναι συνδεδεμένο με την κυστεΐνη (συνοψίζεται στο Σχήμα 6 -Β, που συζητείται αναλυτικά αργότερα). Η έρευνά μας αποκάλυψε ότι το Cys86 εμπλέκεται στη σπαλμιτοϋλίωση αλλά δεν συμβάλλει στην αλληλεπίδραση με το FKBP11. Υποθέτουμε ότι ορισμένα άλλα υπολείμματα στον βρόχο CP που βρίσκεται κοντά στην περιοχή TM1 συμβάλλουν στην αλληλεπίδραση. Προηγούμενες έρευνες αποκάλυψαν επίσης ότι το IFITM5 που εκφράζεται στα κύτταρα ετερόλογων ινοβλαστών NIH3T3 εμφάνισε άμεσες αλληλεπιδράσεις με το CD81, την πρωτεΐνη 31 που σχετίζεται με τον υποδοχέα των Β κυττάρων ( BCAP31), και το υδροξυστεροειδές (17-βήτα) αφυδρογονάση 7 (HSD17b7). Αυτές οι τρεις πρωτεΐνες συνδέονται με το IFITM5 χωρίς την S-παλμιτοϋλίωση (μορφή χαμηλής μοριακής μάζας. βλέπε Εικόνα 3 -b στην αναφορά [19] . και Εικόνα 1 -Β στην αναφορά [28] . Στα κύτταρα ινοβλαστών, η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 είναι ανεπαρκής [19] . Αυτές οι αλληλεπιδράσεις δεν παρατηρούνται στα εγγενή κύτταρα οστεοβλαστών και επομένως είναι μη ειδικές. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα γεγονότα, υποθέτουμε ότι η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 προάγει την ειδική αλληλεπίδραση με το FKBP11 στα κύτταρα οστεοβλαστών. Ο ρόλος που διαδραματίζει η S-παλμιτουλίωση του IFITM5 στην ανοσολογική δραστηριότητα των οστεοβλαστικών κυττάρων θα συζητηθεί με το συνδυασμό των αποτελεσμάτων από τις παρούσες και τις προηγούμενες μελέτες. Μια συγκεκριμένη αλληλεπίδραση μεταξύ IFITM5 και FKBP11 θα πρέπει να είναι απαραίτητη για να σχηματιστεί το σύμπλεγμα IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Το CD81, γνωστό και ως TAPA-1, είναι μέλος της οικογένειας πρωτεϊνικών μεμβρανών τετρασπανίνης και συστατικό του συμπλέγματος συνυποδοχέων Β-κυττάρων που μεσολαβεί στη σηματοδότηση των Β-κυττάρων για ανοσοαποκρίσεις. Όταν σχηματίζεται αυτό το σύμπλεγμα, η CD9, μια πρωτεΐνη συνεργάτης με το CD81, διαχωρίζεται από το σύμπλεγμα FKBP11-CD81-FPRP/CD9 και κατά συνέπεια επάγει την ειδική έκφραση των οστεοβλαστών των επαγόμενων από ιντερφερόνη γονιδίων, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m και MHC κατηγορίας I. γονίδιο αντιγόνου [28] . Εάν η προκαλούμενη από σπαλμιτοϋλίωση ειδική αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11 χανόταν, το σύμπλεγμα IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP δεν θα σχηματιζόταν και κατά συνέπεια η επαγόμενη από ιντερφερόνη έκφραση γονιδίου θα ανασταλεί επειδή το CD9 θα παρέμενε συνδεδεμένο με το FKBP11-CD81 Σύμπλεγμα FPRP/CD9. Από αυτή την άποψη, υποθέτουμε ότι το IFITM5 εμπλέκεται στη δραστηριότητα του ανοσοποιητικού συστήματος στα κύτταρα οστεοβλαστών και η αλληλεπίδραση του S-παλμιτοϋλιωμένου IFITM5 με το FKBP11 ρυθμίζει την ανοσολογική δραστηριότητα. Επιπλέον, προτάθηκε ότι η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 συμβάλλει στην ο σχηματισμός οστικού οστού, συμπεριλαμβανομένης της μορφολογίας και του χρόνου για ανοργανοποίηση, στα κύτταρα οστεοβλαστών (Εικόνα 5). Είναι δύσκολο να συμπεράνουμε επί του παρόντος ότι η έλλειψη της S-παλμιτουλίωσης στο IFITM5 προκαλεί τη διάχυση των οστικών οστών (πίνακας b του Σχήματος 5 -Ε). μπορούμε να πούμε, ωστόσο, ότι το IFITM5 πιθανότατα δεν θα είναι S-παλμιτοϋλιωμένο στα κύτταρα παρουσία 2BP. Ενώ το 2BP χρησιμοποιείται συνήθως ως αναστολέας της παλμιτουλίωσης, στοχεύει επίσης πολλά μεταβολικά ένζυμα [33, 34]. Έτσι, είναι επίσης δύσκολο να ερμηνευτούν τα αποτελέσματα της μακροχρόνιας επώασης των οστεοβλαστικών κυττάρων παρουσία 2ΒΡ. Σε κάθε περίπτωση, πρόκειται για ενδιαφέρουσες και βασικές παρατηρήσεις όσον αφορά την αποσαφήνιση του ρόλου που διαδραματίζει η S-παλμιτοϋλίωση του IFITM5 στον σχηματισμό οστών και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες. Το Σχήμα 6 περιγράφει έναν πιθανό μηχανισμό της αλληλεπίδρασης του IFITM5 με το FKBP11 και τον ρόλο του IFITM5 στη λειτουργία των οστεοβλαστικών κυττάρων μέσω σύγκρισης με το IFITM3. Στην περίπτωση του IFITM3, όπως φαίνεται στο Σχήμα 6 -Α, παρατηρούνται τα ακόλουθα. (i) Οι τρεις κυστεΐνες είναι όλες S-παλμιτοϋλιωμένες (ii). Η S-παλμιτοϋλίωση οδηγεί στη ομαδοποίηση και τη σωστή τοποθέτηση των μορίων IFITM3 στη μεμβράνη (iii). Η σπαλμιτοϋλίωση και η ακόλουθη ομαδοποίηση είναι ζωτικής σημασίας για την αντοχή στον ιό της γρίπης. Όταν το IFITM3 δεν έχει τη σπαλμιτοϋλίωση, τα μόρια IFITM3 δεν συγκεντρώνονται, γεγονός που οδηγεί σε σημαντική μείωση της αντιϊκής δραστηριότητας. Από την άλλη πλευρά, το σχήμα 6 -Β δείχνει ότι οι ακόλουθες παρατηρήσεις γίνονται στην περίπτωση του IFITM5. (i) Το Cys86, συν ένα ή δύο άλλα υπολείμματα κυστεΐνης στο IFITM5, δηλ., Cys52 και/ή Cys53, είναι S-παλμιτοϋλιωμένα (ii). Το S-παλμιτοϋλιωμένο IFITM5 είναι σε θέση να αλληλεπιδρά ειδικά με το FKBP11. Η αλληλεπίδραση θεωρείται ότι διαμεσολαβείται από το παλμιτικό οξύ(α) που είναι συνδεδεμένο με την κυστεΐνη(ες) που βλέπει προς την επιφάνεια αλληλεπίδρασης στο FKBP11. Το Cys86 εμπλέκεται στην S-παλμιτοϋλίωση αλλά όχι στην αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11. Προς το παρόν, ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τον ρόλο της S-παλμιτουλίωσης του IFITM5 για τον εντοπισμό στη μεμβράνη. Όταν η S-παλμιτοϋλίωση επηρεάζει τον εντοπισμό του IFITM5 όπως στην περίπτωση του IFITM3 [10] , τα S-παλμιτοϋλιωμένα μόρια IFITM5 θα πρέπει να εντοπίζονται στη μεμβράνη ή τα αποπαλμιτοϋλιωμένα μόρια θα πρέπει να αποεντοπίζονται. Η απώλεια της αλληλεπίδρασης μεταξύ IFITM5 και FKBP11 θα μπορούσε να οφείλεται σε επανατοπισμό του αποπαλμιτοϋλιωμένου IFITM5 που αποτρέπει τη συσχέτισή του με το FKBP11 (iii). Το σπαλμιτοϋλιωμένο IFITM5 αλληλεπιδρά με το σύμπλοκο FKBP11-CD81-FPRP/CD9 μέσω του FKBP11, το οποίο επάγει τη διάσταση του CD9 από το σύμπλοκο και την έκφραση 5 ανοσολογικά σχετικών γονιδίων. Τέλος, το IFITM5 σχηματίζει το σύμπλεγμα IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Είναι άγνωστο προς το παρόν ποια από τις τρεις καταστάσεις (i)~(iii) που απεικονίζονται στο Σχήμα 6 -Β είναι σημαντική για την ανοργανοποίηση των οστών των οστεοβλαστικών κυττάρων. Η έλλειψη της S-παλμιτοϋλίωσης επηρεάζει την αλληλεπίδραση με το FKBP11, το οποίο θα μπορούσε να ευθύνεται για τον ακόλουθο σχηματισμό συμπλόκου και έκφραση γονιδίου. Επιπλέον, επηρεάζεται και ο σχηματισμός οστικού οστού. Σημειώστε ότι ο ρόλος της σπαλμιτοϋλίωσης έχει εμπλακεί στον σχηματισμό οστών [35] . Υποδεικνύεται ότι η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 παίζει ρόλο όχι μόνο για τη ρύθμιση της ανοσολογικής δραστηριότητας αλλά και για τον σχηματισμό οστού. Συμπερασματικά, αποκαλύψαμε την S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 και το ρόλο της στην αλληλεπίδραση με το FKBP11. Όχι μόνο η ανοσολογική δραστηριότητα αλλά και η ανοργανοποίηση των οστών στα κύτταρα των οστεοβλαστών επηρεάζεται από την S-παλμιτοϋλίωση. Γενικά, ο λειτουργικός ρόλος της S-παλμιτουλίωσης είναι διαφορετικός για κάθε πρωτεΐνη [36]. Για πολλές πρωτεΐνες, ο κύκλος παλμιτουλίωσης και αποπαλμιτουλίωσης είναι συστατικός και ρυθμίζεται από ένζυμα. Με βάση τα παρόντα αποτελέσματα, είναι δύσκολο να εξεταστεί (i) εάν η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 είναι συστατική ή ρυθμιζόμενη, ή (ii) πότε και πού το IFITM5 είναι S-παλμιτοϋλιωμένο στα κύτταρα οστεοβλαστών. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες και βρίσκονται σε εξέλιξη.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 742, "text": "τρία" } ], "id": 569, "question": "Πόσα υπολείμματα κυστεΐνης περιέχονται στην πρώτη διαμεμβρανική περιοχή του IFITM3;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1665, "text": "2-βρωμοπαλμιτικό οξύ (2BP)" } ], "id": 570, "question": "Τι αναστέλλει την S-παλμιτοϋλίωση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 26028, "text": "IFITM5 με FKBP11" } ], "id": 571, "question": "Ποια αλληλεπίδραση αναστέλλεται από την παρουσία του 2-βρωμοπαλμιτικού οξέος (2BP);" }, { "answers": [ { "answer_start": 3851, "text": "S-παλμιτοϋλίωση στην πρωτεΐνη" } ], "id": 573, "question": "Τι ρυθμίζει την αντιική δράση του IFITM3;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6817, "text": "η περιοχή ανάντη του γονιδίου ifitm5 στερείται των ρυθμιστικών στοιχείων της ιντερφερόνης" } ], "id": 575, "question": "Γιατί η έκφραση του IFITM5 δεν προωθείται από τις ιντερφερόνες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7174, "text": "~ 65% ομοιότητα" } ], "id": 576, "question": "Ποια είναι η ομοιότητα αμινοξέων μεταξύ του IFITM5 και των άλλων πρωτεϊνών IFITM;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7230, "text": "~ 85% ομοιότητα" } ], "id": 577, "question": "Ποια είναι η ομοιότητα αμινοξέων μεταξύ των IFITM 1, IFITM 2 και IFITM 3;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7321, "text": "ασπαρτικό" } ], "id": 580, "question": "Ποιο αμινοξύ μπορεί να εμπλέκεται στη δέσμευση ασβεστίου στην C-τερματική περιοχή μιας πρωτεΐνης;" } ] } ] }
{ "paragraphs": [ { "context": "Πρώτη πλήρης ακολουθία γονιδιώματος ενός γαλλικού στελέχους κορωνοϊού βοοειδώνhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5477389/SHA: eef0ecf5b8e7b179dadaef967e65f2ab68f021e1Συγγραφείς: Kin, Nathalie; Guerard, Pauline; Diancourt, Laure; Caro, Valérie; Vabret, Astrid; Ar Gouilh, MeriadegΗμερομηνία: 2017-05-25DOI: 10.1128/genomea.00319-17 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: Αναλύσαμε την αλληλουχία της πρώτης πλήρους αλληλουχίας γονιδιώματος Bovine coronavirus (BCoV) από τη Γαλλία. Αυτός ο BCoV αναλύθηκε απευθείας από ένα δείγμα κοπράνων που συλλέχθηκε από ένα μόσχο στη Νορμανδία το 2014. Κείμενο: Ο κορωνοϊός Β προβάτου (BCoV) ανήκει στην τάξη Nidovirales, στην οικογένεια Coronavirinae, στην υποοικογένεια Coronavirinae και στον Betacoronavirus (https://talk. ictvonline.org/ ICTV/proposals/2008.085-122V.v4.Coronaviridae.pdf). Το γονιδίωμά του είναι ένα μονόκλωνο, γραμμικό και μη τμηματοποιημένο RNA περίπου 31 kb. Το BCoV είναι υπεύθυνο για αναπνευστικές και εντερικές ασθένειες στα βοοειδή, ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια του χειμώνα (1, 2) . Μέχρι σήμερα, οι 19 πλήρεις αλληλουχίες γονιδιώματος BCoV που είναι διαθέσιμες στις βάσεις δεδομένων της GenBank (διαβούλευση στις 17 Ιανουαρίου 2017) προέρχονται από τις Ηνωμένες Πολιτείες ή την Ασία. Εδώ, αναφέρουμε την πρώτη πλήρη αλληλουχία γονιδιώματος ενός BCoV που ανιχνεύθηκε στη Γαλλία. Το στέλεχος BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 ελήφθη από δείγμα κοπράνων που συλλέχθηκε από μόσχο 1 εβδομάδας στη Νορμανδία το 2014. Η παρουσία του BCoV στο δείγμα κοπράνων αξιολογήθηκε με χρήση εσωτερικής αντίστροφης μεταγραφής-PCR (RT-PCR) που στοχεύει το γονίδιο Μ (3). Μια βιβλιοθήκη cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και εξαμερή. Ο πλήρης προσδιορισμός αλληλουχίας γονιδιώματος των επικαλυπτόμενων προϊόντων PCR πραγματοποιήθηκε και προς τις δύο κατευθύνσεις, χρησιμοποιώντας αρχικούς εκκινητές και διδεοξυ αλληλουχία Sanger. Οι αντιδράσεις προσδιορισμού αλληλουχίας πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (3). Οι ακολουθίες συναρμολογήθηκαν και σχολιάστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Geneious (έκδοση 5.1.6). Λάβαμε μια αλληλουχία που μετράει 30.847 νουκλεοτίδια. Τα γονίδια orf1ab, HE, S, ns5, E, M και N του ληφθέντος BCoV υποβλήθηκαν σε ανάλυση Blastn. Σύμφωνα με αυτές τις αναλύσεις, το γονίδιο orf1ab (νουκλεοτίδια 20 kb, που βρίσκονται στην 5= πλευρά του γονιδιώματος) σχετίζεται στενά με το στέλεχος HKU23-23-362F του κορωνοϊού καμήλας Dromedary (DcCoV) από τα Ηνωμένα Αραβικά Εμιράτα (αρ. KF906251), με ταυτότητα νουκλεοτιδίου 99,19%. Αντίθετα, τα γονίδια NS2, HE, S, ns5 και M σχετίζονται στενά με το στέλεχος BCoV Bubalus/Italy/179/07-11 (αριθμός προσχώρησης. EU019216), με ταυτότητες νουκλεοτιδίων 99,88%, 99,45%, 99,02%, 98,79% και 99,28%, αντίστοιχα. Το γονίδιο Ε σχετίζεται στενά με το στέλεχος του κινεζικού κορωνοϊού βοοειδών BCV-AKS-01 (accession no. KU886219), με νουκλεοτιδική ταυτότητα 100%. Τέλος, η υψηλότερη βαθμολογία Blastn για το γονίδιο N βρέθηκε με το αμερικανικό εντερικό BCoV-ENT (accession no. AF391541), που σχετίζεται με ταυτότητα νουκλεοτιδίου 100%. Ευθυγράμμιση πολλαπλών αλληλουχιών, συμπεριλαμβανομένων 20 BCoV και 10 βήτα κορωνοϊών κλάδου Α που σχετίζονται στενά με τον BCoV από τη Βόρεια Αμερική, δύο DcCoV από τα Ηνωμένα Αραβικά Εμιράτα και δύο ανθρώπινους κορονοϊούς OC43 (HCoV-OC4 ) στελέχη από τη Γαλλία, πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Muscle που υλοποιήθηκε στο MEGA7 (4, 5) . Η φυλογενετική ανάλυση στο orf1ab επιβεβαιώνει ότι το BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 σχετίζεται στενά με τον κοροναϊό καμήλας Dromedary (DcCoV) HKU23-23-362F. Το γονίδιο orf1ab αυτών των δύο ιών μαζί συγκεντρώθηκε χωριστά από αυτό των ιών BCoV και παρόμοιων με BCoV ιών από τη Βόρεια Αμερική και την Ασία. Αυτό το εύρημα επιβεβαιώνει επίσης τα αποτελέσματα από την προηγούμενη ανάλυσή μας για μερικά γονιδιώματα στα οποία τα γονίδια nsp12, S και N των αμερικανικών και ασιατικών BCoVs ομαδοποιούνται σε ένα σύμπλεγμα που ονομάζεται προσωρινά C 1 . Οι περιοχές κωδικοποίησης nsp12 και N των BCoV από τη Γαλλία και DcCoV από τα Ηνωμένα Αραβικά Εμιράτα συγκεντρώθηκαν μαζί στο C 2. Το γονίδιο DcCoV S εξατομικεύεται και από τα γονίδια HCoV-OC43 και BCoV S. Πιθανά συμβάντα ανασυνδυασμού θα μπορούσαν να προέρχονται από τους αριθμούς DcCoV.Accession. Η πλήρης αλληλουχία γονιδιώματος της απομόνωσης BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 έχει κατατεθεί στη GenBank με τον αριθμό πρόσβασης KX982264.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 912, "text": "31 kb" } ], "id": 917, "question": "Ποιο είναι το μέγεθος του κορωνοϊού των βοοειδών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 857, "text": "μονόκλωνο, γραμμικό και μη τμηματοποιημένο RNA" } ], "id": 918, "question": "Ποια είναι η μοριακή δομή του κοροναϊού των βοοειδών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2139, "text": "30.847 νουκλεοτίδια" } ], "id": 919, "question": "Πόσα νουκλεοτίδια περιέχει ο κορωνοϊός των βοοειδών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2316, "text": "20 kb" } ], "id": 920, "question": "Ποιο είναι το μέγεθος του γονιδίου orf1ab στον κοροναϊό των βοοειδών;" } ] } ] }
{ "paragraphs": [ { "context": "Ειδικά κατά είδος κλινικά χαρακτηριστικά της ανθρώπινης μόλυνσης από κορωνοϊό μεταξύ κατά τα άλλα υγιών εφήβων και ενηλίκων https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4sa14A; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Ημερομηνία: 2018-02-02DOI: 10.1111/irv.12538Άδεια: cc-byAbstract: Ο ανθρώπινος κορωνοϊός (HCoV) είναι μια γνωστή αιτία ασθένειας που μοιάζει με γρίπη (ILI). Σε μια πολυτοπική, παρατήρηση, διαχρονική μελέτη του ILI μεταξύ κατά τα άλλα υγιών εφήβων και ενηλίκων, το 12% των ατόμων ήταν PCR-θετικά για HCoV. Η κατανομή των ειδών ήταν η εξής: HCoV‐OC43 (34%), HCoV‐229E (28%), HCoV‐NL63 (22%) και HCoV‐HKU1 (16%). Δεν παρατηρήσαμε ειδικές για το είδος διαφορές στα κλινικά χαρακτηριστικά της λοίμωξης HCoV, με εξαίρεση τη λοίμωξη από HCoV-HKU1, για την οποία η σοβαρότητα των γαστρεντερικών συμπτωμάτων κινήθηκε υψηλότερα την τέταρτη ημέρα της νόσου. Κείμενο: Κλινικές εκδηλώσεις του ανθρώπινου κοροναϊού (HCoV) Η λοίμωξη ποικίλλει από μια ήπια, αυτοπεριοριζόμενη ασθένεια της ανώτερης αναπνευστικής οδού έως ένα σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας με υψηλό ποσοστό θνησιμότητας. Τα εξαιρετικά λοιμώδη είδη του HCoV ήταν υπεύθυνα για τα κρούσματα του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου (SARS) και του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής. MERS); Τα ποσοστά θνησιμότητας κυμαίνονταν από 14% έως 45%. [1] [2] [3] Αντίθετα, άλλα είδη HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 και HCoV-229E) είναι πολύ πιο διαδεδομένα, πολύ λιγότερο σοβαρά και κοινά αίτια ασθένειας που μοιάζει με γρίπη (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Πέντε προηγούμενες μελέτες έχουν περιγράψει τα ειδικά για το είδος κλινικά χαρακτηριστικά της λοίμωξης από τον HCoV μεταξύ των ενηλίκων. 6, 7, [10] [11] [12] Σε δύο από αυτές τις μελέτες, ένα σημαντικό ποσοστό του πληθυσμού της μελέτης είχε υποκείμενες ιατρικές παθήσεις. 6, 7 Στο παρόν, περιγράφουμε, μεταξύ μιας κοόρτης κατά τα άλλα υγιών εφήβων και ενηλίκων με ασθένεια παρόμοια με τη γρίπη (ILI), τον επιπολασμό και τη σοβαρότητα των συμπτωμάτων που σχετίζονται με τη μόλυνση από HCoV. 13 Ασθενείς ηλικίας 0-65 ετών που παρουσιάζονται για περίθαλψη <72 ώρες μετά την έναρξη των συμπτωμάτων ILI επιλέχθηκαν για συμμετοχή στη μελέτη. Ο ILI ορίστηκε ως θερμοκρασία ≥100,4°F και πονόλαιμος ή ένα από τα ακόλουθα αναπνευστικά συμπτώματα: βήχας, παραγωγή πτυέλων, δύσπνοια ή πόνος στο στήθος. Δικαίωμα συμμετοχής είχαν τόσο νοσηλευόμενοι όσο και εξωτερικοί ασθενείς. Ασθενείς με υποκείμενες ιατρικές παθήσεις (π.χ. διαβήτης, χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια, σοβαρό άσθμα), γυναίκες με εγκυμοσύνη υψηλού κινδύνου ή περίπλοκη και ασθενείς με κακώς ελεγχόμενη ψυχιατρική διαταραχή αποκλείστηκαν. Οι πληροφορίες σχετικά με τα δημογραφικά στοιχεία των ασθενών και την παρουσία/σοβαρότητα των συμπτωμάτων κατά τη στιγμή της εγγραφής συλλέχθηκαν με προσωπική συνέντευξη. Στη συνέχεια, οι συμμετέχοντες έλαβαν οδηγίες σχετικά με τη χρήση ενός καθημερινού ημερολογίου για την καταγραφή της παρουσίας/σοβαρότητας των συμπτωμάτων για 7 ημέρες μετά την αρχική έναρξη των συμπτωμάτων. Η σοβαρότητα των συμπτωμάτων βαθμολογήθηκε σε μια τακτική κλίμακα από 0 (καμία) έως 3 (σοβαρή). Οι βαθμολογίες σοβαρότητας των συμπτωμάτων ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες πέντε μετρήσεις: (i) ατομική βαθμολογία συμπτωμάτων για 20 συμπτώματα, (ii) η βαθμολογία των συμπτωμάτων του ανώτερου αναπνευστικού, που υπολογίστηκε ως το άθροισμα των βαθμολογιών σοβαρότητας για πόνο στο αυτί, καταρροή, πονόλαιμο και φτάρνισμα, iii) η βαθμολογία των κατώτερων αναπνευστικών συμπτωμάτων, που υπολογίζεται ως το άθροισμα των βαθμολογιών σοβαρότητας για βήχα, δυσκολία στην αναπνοή, βραχνάδα και δυσφορία στο στήθος, (iv) τη βαθμολογία γαστρεντερικών συμπτωμάτων, που υπολογίζεται ως το άθροισμα των βαθμολογιών σοβαρότητας για διάρροια, έμετο, ανορεξία, ναυτία , και (Πίνακας 1). Υπήρχε διακύμανση από εποχή σε εποχή στις κύριες αιτίες Τα ευρήματα της μελέτης μας, που διεξήχθησαν σε μια περίοδο 5 ετών σε πέντε γεωγραφικά διασκορπισμένες τοποθεσίες στις ΗΠΑ, καταδεικνύουν ότι ο ανθρώπινος κοροναϊός (HCoV) είναι μια σημαντική αιτία της ασθένειας που μοιάζει με γρίπη (ILI) κυμαινόταν από 4% έως 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Επιπλέον, βρήκαμε ότι το HCoV-OC43 είναι το πιο κοινό είδος μεταξύ των ενηλίκων, όπως έχει αναφερθεί αλλού. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 και HCoV-229E ήταν τα πιο κοινά στελέχη σε εναλλακτικές εποχές, αντανακλώντας μια μεταβλητότητα της κυκλοφορίας του στελέχους HCoV από εποχή σε εποχή που έχει αναφερθεί σε άλλες πολυετείς μελέτες. 4 8 Οι μηχανισμοί με τους οποίους αυτό το συγκεκριμένο είδος προκαλεί αυτά τα συμπτώματα δεν είναι γνωστοί. Τα πλεονεκτήματα αυτής της μελέτης του HCoV σε κατά τα άλλα υγιείς εφήβους και ενήλικες περιλαμβάνουν τον πολυετή και πολυετή σχεδιασμό του, τη χρήση ενός πολυπλεξικού διαγνωστικού πίνακα, την προοπτική συλλογή δεδομένων συμπτωμάτων και τη χρήση μιας κλίμακας σοβαρότητας συμπτωμάτων παρόμοια με αυτή που χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως. 15 Ένας σημαντικός περιορισμός αυτής της μελέτης ήταν η επιλεκτική μας στρατολόγηση ατόμων που είχαν παρουσιαστεί σε μια μονάδα υγειονομικής περίθαλψης για φροντίδα ενός ILI. Ως εκ τούτου, οι περιπτώσεις μας δεν είναι αντιπροσωπευτικές της λοίμωξης από HCoV στην κοινότητα, όπου άτομα με ήπια, αυτοπεριοριζόμενη ασθένεια λόγω HCoV επιλέγουν να μην αναζητήσουν ιατρική φροντίδα για τη διαχείριση του ILI τους. Συνοπτικά, δείξαμε ότι ο HCoV είναι σημαντικός αιτία της ILI μεταξύ κατά τα άλλα υγιών εφήβων και ενηλίκων που παρουσιάζονται για ιατρική αξιολόγηση. Αν και υπήρχαν διαφορές στην κατανομή των ειδών ανά ηλικιακή ομάδα, δεν εντοπίσαμε διαφορές μεταξύ των ειδών σε σχέση με το κλινικό φάσμα της νόσου.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 494, "text": "HCoV" } ], "id": 1658, "question": "Ποια είναι η σημαντική αιτία εμφάνισης ασθένειας τύπου γρίπης μεταξύ υγιών εφήβων και ενηλίκων που παρουσιάζονται για ιατρική αξιολόγηση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4459, "text": "HCoV-OC43" } ], "id": 1659, "question": "Ποιο είναι το πιο κοινό είδος του ανθρώπινου κορωνοϊού μεταξύ των ενηλίκων;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1551, "text": "HCoV-HKU1" } ], "id": 1660, "question": "Ποιος ανθρώπινος κορωνοϊός έδειξε συγκεκριμένα κλινικά χαρακτηριστικά του είδους της μόλυνσης του;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4459, "text": "HCoV-OC43 και HCoV-229E" } ], "id": 1719, "question": "Ποια ήταν τα κοινά στελέχη HCOV στην 5ετή μελέτη στις ΗΠΑ;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1551, "text": "HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 και HCoV-229E" } ], "id": 1720, "question": "Ποια είδη είναι πιο διαδεδομένα αλλά λιγότερο σοβαρά;" } ] } ] }
{ "paragraphs": [ { "context": "Ανάπτυξη συστοιχίας ELISA για ταυτόχρονη ανίχνευση πέντε ιών εγκεφαλίτιδαςhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9Authoria; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Χονγκ; Yang, Yinhui Ημερομηνία: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: Ιός Ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας (JEV), ιός εγκεφαλίτιδας που μεταδίδεται από κρότωνες (TBEV) και ιός ανατολικής ιπποειδούς μπορεί να προκαλέσει (EEphalence) συμπτώματα εγκεφαλίτιδας. Η καθιέρωση ακριβών και εύκολων μεθόδων με τις οποίες ανιχνεύονται αυτοί οι ιοί είναι απαραίτητη για την πρόληψη και τη θεραπεία σχετικών μολυσματικών ασθενειών. Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν ακόμη διαθέσιμες κλινικά μέθοδοι ανίχνευσης πολλαπλών αντιγόνων. Μια συστοιχία ELISA, η οποία ανιχνεύει πολλαπλά αντιγόνα, είναι εύκολη στον χειρισμό και φθηνή, έχει τεράστιες δυνατότητες στην ανίχνευση παθογόνων. Σε αυτή τη μελέτη αναπτύχθηκε μια μέθοδος συστοιχίας ELISA για την ταυτόχρονη ανίχνευση πέντε ιών εγκεφαλίτιδας. Επτά μονοκλωνικά αντισώματα κατά πέντε ιών που σχετίζονται με εγκεφαλίτιδα παρασκευάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη της συστοιχίας ELISA. Η ανάλυση συστοιχίας ELISA βασίζεται σε μια μορφή ELISA \"σάντουιτς\" και αποτελείται από ιικά αντισώματα που εκτυπώνονται απευθείας σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων, επιτρέποντας την άμεση ανίχνευση 5 ιών. Η ανεπτυγμένη συστοιχία ELISA αποδείχθηκε ότι έχει παρόμοια ειδικότητα και υψηλότερη ευαισθησία σε σύγκριση με τις συμβατικές ELISA. Αυτή η μέθοδος επικυρώθηκε με διαφορετικές καλλιέργειες ιών και τρία αυγά κοτόπουλου εμβολιασμένα με μολυσμένο ορό ασθενών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ανεπτυγμένη συστοιχία ELISA είναι ευαίσθητη και εύκολη στη χρήση, η οποία θα μπορούσε να έχει δυνατότητα κλινικής χρήσης. Ο ιός sindbis (SV) και ο ιός του δάγκειου πυρετού (DV) είναι αρβοϊοί και προκαλούν συμπτώματα εγκεφαλίτιδας, με μεγάλο εύρος βαρύτητας και ποσοστών θνησιμότητας [1] . Η καθιέρωση μιας ακριβούς και εύκολης μεθόδου για την ανίχνευση αυτών των ιών είναι απαραίτητη για την πρόληψη και τη θεραπεία σχετικών μολυσματικών ασθενειών. Επί του παρόντος, η ELISA και η IFA είναι οι κλινικά διαθέσιμες μέθοδοι για την ανίχνευση των ιικών αντιγόνων της εγκεφαλίτιδας, αλλά θα μπορούσαν να ανιχνεύσουν μόνο ένα παθογόνο σε μία ανάλυση [2, 3]. Υπάρχει μια ποικιλία διαφορετικών μεθόδων για την ταυτοποίηση πολλαπλών αντιγόνων σε ένα δείγμα ταυτόχρονα, όπως δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση γέλης, τσιπ πρωτεΐνης, φασματομετρία μάζας και τεχνολογία διάταξης εναιωρήματος [4] [5] [6] . Ωστόσο, η εφαρμογή αυτών των τεχνικών στην ανίχνευση παθογόνων βρίσκεται ακόμα σε πρώιμο στάδιο, ίσως λόγω της περίπλοκης χρήσης και του υψηλού κόστους. Οι συστοιχίες αντισωμάτων για ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό πολλαπλών αντιγόνων θεωρούνται οι πιο ακριβείς μέθοδοι [7] [8] [9] [ 10] . Το Liew [11] επικύρωσε μία πολυπλεξία ELISA για την ανίχνευση 9 αντιγόνων. Ο Anderson [12] χρησιμοποίησε ELISA μικροσυστοιχίας για πολλαπλή ανίχνευση αντισωμάτων σε αντιγόνα όγκου στον καρκίνο του μαστού και έδειξε ότι οι δοκιμασίες συστοιχίας που βασίζονται σε ELISA είχαν το ευρύτερο δυναμικό εύρος και τις χαμηλότερες απαιτήσεις όγκου δείγματος σε σύγκριση με τις άλλες δοκιμασίες. Ωστόσο, η εφαρμογή της ELISA- Οι βασισμένες συστοιχίες περιορίζονται επί του παρόντος στην ανίχνευση καρκινικών δεικτών ή ιντερλευκινών. δεν έχει αναφερθεί ανίχνευση παθογόνων. Σε αυτή τη μελέτη, αναπτύξαμε μια συστοιχία βασισμένη σε ELISA για την ταυτόχρονη ανίχνευση πέντε ιών εγκεφαλίτιδας. Παρασκευάστηκαν επτά ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα έναντι πέντε ιών εγκεφαλίτιδας και χρησιμοποιήθηκαν για την καθιέρωση μιας δοκιμασίας σειράς ELISA. Η δοκιμασία επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας καλλιεργημένους ιούς και εμβολιασμένα αυγά κοτόπουλου με ορούς ασθενών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αυτή η μέθοδος συνδύαζε το πλεονέκτημα της ELISA και της συστοιχίας πρωτεϊνών (πολλαπλή και ευκολία χρήσης) και έχει δυνατότητες για την ταυτοποίηση του ιού της κλινικής εγκεφαλίτιδας. Τα μονοκλωνικά αντισώματα παρασκευάστηκαν από κυτταρικές σειρές υβριδώματος που κατασκευάστηκαν από τους Prof. Zhu et al. Ο καθαρισμός διεξήχθη με χρωματογραφία ανοσοσυγγένειας σε σεφαρόζη συγγένειας πρωτεΐνης G [13] . Επιλέχθηκαν ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα (4D5 κατά JEV, 2B5 έναντι TBEV, 1F1 έναντι SV, 2B8 κατά του ορότυπου 2 DV, 4F9 κατά του ορότυπου 4 DV, 4E11 κατά του EEEV και 2A10 έναντι του Flavivirus). Όλα τα αντισώματα αναπτύχθηκαν σύμφωνα με τυπικές διαδικασίες. Χρησιμοποιώντας τα 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 και 4E11 ως αντισώματα σύλληψης, τα αντισώματα ανίχνευσης (2A10, 1 F1 και 4E11) συζεύχθηκαν με εστέρα βιοτίνης-NHS Γερμανίας (Pierce, ) στους 4°C για 3 ώρες σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η μη ενσωματωμένη βιοτίνη αφαιρέθηκε με στήλη Desalt spin (Pierce). Ανοσολογικές αντιδράσεις αναφέρθηκαν από Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) και Super Signal ELISA Femto Maximum ευαίσθητο υπόστρωμα. Καθαρισμένο αντίσωμα κατσίκας-αντι ποντικού χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. JEV και DV καλλιεργήθηκαν σε κύτταρα C6/36. Τα SV, TBEV και EEEV καλλιεργήθηκαν σε κύτταρα ΒΗΚ-21. Η καλλιέργεια των TBEV και EEEV διεξήχθη σε εγκαταστάσεις βιοασφάλειας επιπέδου 3, ωστόσο, JEV, DV και SV διεξήχθησαν σε εγκαταστάσεις βιοασφάλειας επιπέδου 2. Οι τίτλοι του ιού προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο μολυσματικής δόσης ιστοκαλλιέργειας 50% (TCID50). Όλες οι καλλιέργειες απενεργοποιήθηκαν με 0,025% β-προπιονολακτόνη στους 4°C όλη τη νύχτα, στη συνέχεια στους 37°C για 1 ώρα για να αποσυντεθεί η β-προπιονολακτόνη. Τα αντισώματα εντοπίστηκαν με χρήση μηχανής BIODOT (BD6000; Καλιφόρνια, ΗΠΑ) σε πλάκες ELISA (30 /τελεία). Οι πλάκες μπλοκαρίστηκαν με 3% BSA-PBS σε 37°C για 1 ώρα, ακολουθούμενο από πλύση 3 φορές με PBS που περιέχει 0,1% Tween-20 για 2 λεπτά η κάθε μία. Στη συνέχεια, οι πλάκες ξηράνθηκαν, σφραγίστηκαν και αποθηκεύτηκαν στους 4°C πριν από τη χρήση [11]. Κατά την κηλίδωση, αξιολογήθηκαν διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα κηλίδωσης και συγκεντρώσεις μονοκλωνικών αντισωμάτων σύλληψης για να βελτιστοποιηθεί η ανάλυση της σειράς ELISA. Η βελτιστοποίηση αξιολογήθηκε με μορφολογία κουκκίδων και ένταση σήματος. Τα εξετασθέντα ρυθμιστικά κηλίδωσης περιελάμβαναν 1 x φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS), PBS +20% γλυκερόλη και 1 x PBS + 20% γλυκερίνη + 0,004% Triton-X100. Συγκρίθηκε ένα εύρος συγκεντρώσεων μονοκλωνικών αντισωμάτων (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 και 0,2 mg/ml). Μετά από μια διπλή μορφή σάντουιτς αντισώματος, οι τυπωμένες πλάκες επωάστηκαν διαδοχικά με απενεργοποιημένες ιικές καλλιέργειες, επισημασμένο με βιοτίνη ανιχνευτικό αντίσωμα-bella, HPR αβιδίνη και υπόστρωμα, ακολουθούμενη από αξιολόγηση σήματος. Η δέσμευση αντιγόνου πραγματοποιήθηκε σε PBS (που περιέχει 0,1% Tween-20 και 5% FCS) στους 37°C για 2 ώρες, ακολουθούμενη από πλύση 3 φορές (1 × PBS που περιέχει 0,1% Tween- 20). Η επώαση των πλακών ELISA με κοκτέιλ βιοτινυλιωμένων αντισωμάτων ανίχνευσης πραγματοποιήθηκε σε PBS (που περιέχει 0,1% Tween-20 και 5% FCS) στους 37°C για 2 ώρες. Μετά το πλύσιμο, αναφέρθηκε ειδική δέσμευση των αντισωμάτων ανίχνευσης με στρεπταβιδίνη-HRP και χρωματίστηκε με ευαίσθητο υπόστρωμα Super Signal ELISA Femto Maximum (Thermo Scientific, Rockford, ΗΠΑ) [11, 14, 15] . Η οπτικοποίηση της πλάκας πραγματοποιήθηκε σε αναλυτή εικόνας ψυχρού CCD AE 1000 (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, Κίνα). Η ένταση του σήματος και το φόντο κάθε σημείου διαβάστηκε και καταγράφηκε με το λογισμικό \"Monster\". Τα θετικά σήματα ορίστηκαν ως τιμή σήματος > 400 και τιμή σήματος (δείγμα)/τιμή σήματος (αρνητική) > 2. Τα πανομοιότυπα αντισώματα που χρησιμοποιούνται στη μορφή συστοιχίας ELISA δοκιμάστηκαν επίσης σε μια συμβατική μορφή ELISA για να προσδιοριστεί η διαφορά ευαισθησία και ειδικότητα των δύο μεθόδων. Οι συμβατικές ELISA διεξήχθησαν ταυτόχρονα με τις δοκιμασίες συστοιχίας ELISA για να εξασφαλιστούν παρόμοιες συνθήκες αντίδρασης. Οι συμβατικές ELISA πραγματοποιήθηκαν με τον ίδιο τρόπο με τη συστοιχία ELISA, με τη διαφορά ότι τα αντισώματα επικαλύφθηκαν σε συγκέντρωση 2 μg/mL σε PBS (pH 7,4) και το υπόστρωμα TMB χρησιμοποιήθηκε αντί του Super Signal ELISA Femto Maximum ευαίσθητο υπόστρωμα [ 16, 17] .Τρία δείγματα ορού συλλέχθηκαν από ασθενείς με συμπτώματα από το νευρικό σύστημα και ιστορικό τσιμπήματος κροτώνων. Τα δείγματα ορού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη και στη συνέχεια εμβολιάστηκαν στις αλλαντοϊκές κοιλότητες των αυγών κοτόπουλου. 3 ημέρες αργότερα, το υγρό συλλέχθηκε και χωρίστηκε σε δύο μέρη (ένα για αδρανοποίηση και ένα για εκχύλιση RNA). Το RNA και τα αδρανοποιημένα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -70°C πριν από τη χρήση. Το RNA εκχυλίστηκε από τα εμβολιασμένα αυγά κοτόπουλου χρησιμοποιώντας ένα μίνι κιτ RNeasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλες οι διαδικασίες εκχύλισης RNA διεξήχθησαν σε εγκαταστάσεις BSL-3. Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές χρησιμοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18] . Η RT-PCR πραγματικού χρόνου διεξήχθη με κιτ Quti-teck q-RT-PCR (Qiagen Inc,). Η αντίδραση αποτελούνταν από 10 μL ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης 2 × (0,2 μL ενζύμου αντίστροφης μεταγραφής και 250 nmol/l εκκινητές και ανιχνευτές). RNA και απιονισμένο νερό προστέθηκαν σε τελικό όγκο 20 μl. Η PCR πραγματοποιήθηκε με LightCycler 2.0 (Roche, Ελβετία) [19] . Βελτιστοποίηση της ανάλυσης συστοιχίας ELISA Η διάταξη της διάταξης με κηλίδες απεικονίζεται στο Σχήμα 1 και διερευνήθηκε η αποτελεσματικότητα τριών διαφορετικών ρυθμιστικών κηλίδων στην ποιότητα των εκτυπωμένων συστοιχιών ELISA με παρατήρηση μορφολογίας κηλίδων και σύγκριση έντασης σήματος. Η συγκέντρωση κηλίδων των αντισωμάτων σύλληψης κυμαινόταν από 0,2 έως 0,0125 mg/ml (το καθένα αραιώθηκε σειριακά 2 φορές). Η αποτελεσματικότητα της συγκέντρωσης κηλίδωσης των αντισωμάτων σύλληψης αξιολογήθηκε με ανίχνευση καλλιέργειας ιού, η κατάλληλη συγκέντρωση κηλίδωσης προσδιορίστηκε με έναν συνδυασμό ελαχιστοποιημένης διασταυρούμενης αντίδρασης και υψηλότερης έντασης σήματος. Το Σχήμα 1 απεικονίζει τη διάταξη της διάταξης και το Σχήμα 2 δείχνει το αποτέλεσμα των τριών ρυθμιστικών διαλυμάτων κηλίδωσης και της συγκέντρωσης κηλίδων του αντισώματος 2Β5 με ανίχνευση καλλιέργειας ιού ΤΒΕ. Διεξήχθη επίσης ανίχνευση διασταυρούμενης αντίδρασης εφαρμόζοντας καλλιέργειες JEV, YF και DV. Παρατήρηση μορφολογίας κηλίδων (Εικόνες 2a, b και 2c) έδειξε ότι το ρυθμιστικό κηλίδων που περιέχει PBS με 20% γλυκερόλη παρήγαγε μορφολογία ουράς κηλίδας. ρυθμιστικά διαλύματα που περιέχουν μόνο PBS και PBS με 20% γλυκερίνη +0,004% Triton-X100 έδωσαν καλή μορφολογία κηλίδων (στρογγυλή και πλήρη). Ρυθμιστικά διαλύματα που περιέχουν PBS με 20% γλυκερίνη και PBS με 20% γλυκερίνη+0,004% Triton-X100 παρήγαγαν υψηλότερες εντάσεις σήματος από το PBS μόνο. Έτσι, PBS με 20% γλυκερόλη + 0,004% Triton-X100 υιοθετήθηκε ως το βελτιστοποιημένο ρυθμιστικό κηλίδωσης για τα επόμενα πειράματα. Ταυτόχρονα, η αξιολόγηση της συγκέντρωσης κηλίδων πρότεινε ότι τα 0,05 mg/ml ήταν η βέλτιστη. Σε αυτή τη συγκέντρωση, η ένταση του σήματος ήταν υψηλότερη και η διασταυρούμενη αντίδραση δεν εμφανίστηκε (Εικόνα 2δ). Συνεπώς, η βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης κηλίδωσης άλλων αντισωμάτων σύλληψης (4D5, 1F1, 4E11 και 2B8) έδειξε ότι τα 0,05 mg/ml ήταν επίσης κατάλληλα (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Η βελτιστοποιημένη διάταξη της διάταξης ELISA φαίνεται στο Σχήμα 3, η οποία εφαρμόστηκε στο μετά από πειράματα. Η επιτυχής ανίχνευση ιικών παθογόνων απαιτεί μια δοκιμή με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Για να αξιολογηθεί η απόδοση των σχεδιασμένων συστοιχιών αντισωμάτων, εξετάστηκε η ειδικότητα και η ευαισθησία των μεμονωμένων αναλυτών. Δοκιμάζοντας σειριακά αραιωμένες ιικές καλλιέργειες, συμπεριλαμβανομένων των DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV και EEEV, συγκρίθηκαν η ευαισθησία της σειράς ELISA και της πανομοιότυπης συμβατικής ELISA (Πίνακας 1). Το όριο ανίχνευσης των δύο μεθόδων συγκρίθηκε και αποδείχθηκε. Η δοκιμή διασταυρούμενης αντιδραστικότητας διεξήχθη χρησιμοποιώντας καλλιέργειες BHK-21 και κυτταρόλυμα vero, ιού κίτρινου πυρετού (YFV) (5 × 10 5 TCID 50 /ml, καλλιέργειες ιού Δυτικού Νείλου (WNV) (2 × 10 6 TCID 50 /ml) και τον ιό της δυτικής εγκεφαλίτιδας των ίππων (1 × 10 7 TCID 50 /ml). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ούτε η συστοιχία ELISA ούτε η παραδοσιακή ELISA παρουσίασαν διασταυρούμενη αντιδραστικότητα. Ίσοι όγκοι καλλιεργημένων TBEV, JEV, DV-2, DV-4, SV και EEEV παρασκευάστηκαν για ανίχνευση ενός δείγματος. δύο ή τρεις από τις καλλιέργειες αναμίχθηκαν για ανίχνευση πολυπλεξίας. Σε όλες τις δοκιμές χρησιμοποιήθηκε ένα κοκτέιλ συζευγμένου αντισώματος βιοτίνης (2A10, 4E11 και 1F1). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι για όλους τους συνδυασμούς ιών, κάθε ιός ανιχνεύτηκε ειδικά, χωρίς ψευδώς θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα (Εικόνες 4 και 5). Αυγά κοτόπουλου εμβολιασμένα με μολυσμένο ανθρώπινο ορό χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση της ανάλυσης συστοιχίας ELISA. Όλα τα δείγματα έδειξαν υψηλά σήματα αντίδρασης με το αντίσωμα σύλληψης 2Β5, το οποίο ήταν ειδικό για το TBEV (Εικόνα 6b). Η δοκιμασία συστοιχίας ELISA πρότεινε ότι και οι τρεις ασθενείς είχαν μολυνθεί όλοι με TBEV. Για να επαληθευτούν τα αποτελέσματα που δοκιμάστηκαν με συστοιχία ELISA, το RNA που εκχυλίστηκε από αυγά κοτόπουλου εφαρμόστηκε σε μια δοκιμασία RT-PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιώντας εκκινητές και ανιχνευτές που στοχεύουν το TBEV. Τα αποτελέσματα ήταν επίσης θετικά (Εικόνα 6α). Τα συναινετικά αποτελέσματα ανίχνευσης επιβεβαίωσαν ότι η ανάλυση ELISAarray ήταν αξιόπιστη. Για να χρησιμοποιηθεί ευρέως στο κλινικό περιβάλλον, το σύστημα ανίχνευσης θα πρέπει να είναι εύκολο στη χρήση και να μπορεί να εκτελεστεί από μη εκπαιδευμένο προσωπικό με μικρή εργαστηριακή και πειραματική εμπειρία. Επιπλέον, όταν ο όγκος των κλινικών δειγμάτων είναι περιορισμένος και ένας αυξανόμενος αριθμός παθογόνων ανά δείγμα πρέπει να ελεγχθεί, το σύστημα ανίχνευσης θα πρέπει να είναι υψηλής απόδοσης ώστε να επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση πολλαπλών παθογόνων [6, 20, 21]. Η πολλαπλή ανίχνευση, η εύκολη χρήση και η προσιτή τιμή είναι απαιτήσεις για μεθόδους ανίχνευσης στο κλινικό περιβάλλον. Έτσι, μια συστοιχία ELISA, η οποία συνδυάζει τα πλεονεκτήματα της σειράς ELISA και πρωτεϊνών, πληροί τις παραπάνω απαιτήσεις. Έχει αναφερθεί ότι μια συστοιχία ELISA έχει χρησιμοποιηθεί στη διάγνωση του καρκίνου και της αυτοαλλεργικής νόσου [7, 12]. Ωστόσο, καμία μελέτη δεν έχει αναφέρει την ανίχνευση ιικών παθογόνων. Σε αυτή τη μελέτη, αναπτύξαμε μια μέθοδο πολλαπλής ELISA σε μορφή σάντουιτς διπλού αντισώματος για την ταυτόχρονη ανίχνευση πέντε ιικών παθογόνων που σχετίζονται με την εγκεφαλίτιδα. Η παραγωγή ενός αξιόπιστου τσιπ αντισωμάτων για την αναγνώριση μικροοργανισμών απαιτεί προσεκτικό έλεγχο σύλληψης αντισωμάτων 14] . Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα πρέπει να ελαχιστοποιηθεί και η συγγένεια του αντισώματος είναι εξίσου σημαντική με την ειδικότητα. Αρχικά, ετοιμάσαμε και εξετάσαμε 23 μονοκλωνικά αντισώματα έναντι οκτώ ιών και επαληθεύσαμε την ειδικότητα και τη συγγένεια με τους ιούς στόχους με μια δοκιμασία ανοσοφθορισμού. Στη συνέχεια, τα αντισώματα υποβλήθηκαν σε διαλογή με μια συστοιχία ELISA με μια μορφή σάντουιτς ELISA διπλού αντισώματος. Τα αντισώματα που παρήγαγαν διασταυρούμενη αντιδραστικότητα και χαμηλά θετικά σήματα αποκλείστηκαν. Τέλος, έξι αντισώματα επιλέχθηκαν ως αντισώματα σύλληψης. Ένα άλλο μονοκλωνικό αντίσωμα, το 2A10, το οποίο μπορούσε να αντιδράσει ειδικά με όλους τους ιούς του γένους Flavivirus χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι των DV, JEV και TBEV. Για την ανίχνευση των EEEV και SV, αν και τα αντισώματα ανίχνευσης και παγίδευσης ήταν τα ίδια (1F1 και 4E11, αντίστοιχα), τα αντισώματα παρήγαγαν εξαιρετικά θετικά σήματα. Ο επίτοπος δεν ορίστηκε. Ωστόσο, υποπτευόμαστε ότι και τα δύο αντισώματα στοχεύουν στην επιφάνεια των ιοσωμάτων. Καθώς ένα ιοσωμάτιο εξέρχεται καθώς εμφανίζονται πολλά με τον ίδιο επίτοπο, επομένως δεν παρουσιάστηκε καμία παρέμβαση χρησιμοποιώντας το ίδιο αντίσωμα στη δοκιμασία τύπου σάντουιτς διπλού αντισώματος. Επί του παρόντος, η διαθεσιμότητα αντισωμάτων κατάλληλων για μια διαγνωστική ανάλυση με μορφή συστοιχίας είναι ένα σημαντικό πρόβλημα. Στην ανάλυση συστοιχίας ELISA, υπάρχει επίσης αυτό το πρόβλημα. Λόγω του περιορισμού των διαθέσιμων αντισωμάτων, αυτή η ανάλυση μπορούσε να ανιχνεύσει μόνο 5 παθογόνα. Στο μέλλον, με αυξανόμενους αριθμούς κατάλληλων αντισωμάτων, ειδικά ειδικών αντισωμάτων κατά του Flavivirus, αυτή η συστοιχία ELISA ενδέχεται να είναι σε θέση να δοκιμάσει περισσότερα παθογόνα και να έχει μεγαλύτερη πιθανή χρήση. Για να γίνει η ανάλυση πιο επιδεκτική στην ανίχνευση πολλαπλών ιών, το πρωτόκολλο ανάλυσης βελτιστοποιήθηκε. Εκτός από το ρυθμιστικό διάλυμα σημείων, συγκρίθηκαν και αξιολογήθηκαν επίσης η συγκέντρωση αντισώματος σύλληψης και οι διαφορετικές μέθοδοι απενεργοποίησης του ιού (θέρμανση και β-προπιολακτόνη). Η θερμική απενεργοποίηση πραγματοποιήθηκε με θέρμανση των ιικών καλλιεργειών στους 56°C για 1 ώρα, και η αδρανοποίηση της β-προπιολακτόνης πραγματοποιήθηκε με την προσθήκη β-προπιολακτόνης στο προϊόν διατηρεί καλύτερη αντιγονικότητα από τη μέθοδο απενεργοποίησης θερμότητας. Έτσι, η θεραπεία με β-προπιολακτόνη επιλέχθηκε ως μέθοδος απενεργοποίησης του ιού. Η συμβατική ELISA είναι μια τυπική μέθοδος σε πολλά διαγνωστικά εργαστήρια. Συγκρίναμε τη συστοιχία ELISA με μια συμβατική ELISA και επιβεβαιώσαμε ότι το πλεονέκτημα της συστοιχίας ELISA ήταν εμφανές με συγκρίσιμη ειδικότητα και υψηλότερη ευαισθησία από την ELISA. Ο χρόνος που απαιτείται για τη συστοιχία ELISA είναι σημαντικά μικρότερος από ό,τι για τη συμβατική ELISA (4 ώρες έναντι τουλάχιστον 6 ωρών, αντίστοιχα). Επιπλέον, απαιτείται λιγότερη IgG για την εκτύπωση από ό,τι για την επίστρωση πλακών ELISA. Η επικάλυψη ενός μόνο φρεατίου σε πλάκα μικροτιτλοδότησης απαιτεί 100 μl διαλύματος αντισώματος 1 μg/ml, που ισοδυναμεί με 100 ng IgG. Για τη συστοιχία ELISA, απαιτούνται μόνο 30 nl διαλύματος αντισωμάτων 50 μg/ml για κάθε κηλίδα, που ισοδυναμεί με 1,5 ng IgG. Με τα χαρακτηριστικά της ευκολίας χρήσης, της ευαισθησίας, της ειδικότητας και της ακρίβειας, η ανάλυση της σειράς ELISA θα ήταν ευρέως αποδεκτή για κλινική χρήση.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 4405, "text": "9" } ], "id": 3006, "question": "Πόσα αντιγόνα θα μπορούσαν να ανιχνευθούν με το τεστ ELISA multiplex του Liew;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3766, "text": "χρησιμοποιώντας καλλιεργημένους ιούς και εμβολιασμένα αυγά κοτόπουλου με ορούς ασθενών" } ], "id": 3008, "question": "Πώς επικυρώθηκε η ανάλυση ELISA;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4565, "text": "4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 και 4E11" } ], "id": 3009, "question": "Ποια αντισώματα σύλληψης χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9711, "text": "από 0,2 έως 0,0125 mg/ml" } ], "id": 3010, "question": "Ποιο ήταν το εύρος συγκέντρωσης κηλίδων για τα αντισώματα σύλληψης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 10301, "text": "εφαρμόζοντας καλλιέργειες JEV, YF και DV" } ], "id": 3012, "question": "Πώς προσδιορίστηκε η ανίχνευση διασταυρούμενης αντίδρασης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3766, "text": "χρησιμοποιώντας καλλιεργημένους ιούς και εμβολιασμένα αυγά κοτόπουλου με ορούς ασθενών" } ], "id": 3013, "question": "Πώς επικυρώθηκε η ανάλυση συστοιχίας ELISA;" } ] } ] }
{"paragraphs":[{"context":"Αλλαγές στον επιπολασμό της πνευμονική(...TRUNCATED)
{"paragraphs":[{"context":"Σχεδιασμός, Σύνθεση, Αξιολόγηση και Θερ(...TRUNCATED)
{"paragraphs":[{"context":"RNAi Θεραπευτικές Πλατφόρμες για Πνευμον(...TRUNCATED)
{"paragraphs":[{"context":"Πλήρης αλληλουχία γονιδιώματος ενός στ(...TRUNCATED)
{"paragraphs":[{"context":"Προετοιμασία για πιθανή διαρκή μετάδοσ(...TRUNCATED)

End of preview. Expand in Dataset Viewer.

Dataset Card for COVID-QA-el-small

Dataset Summary

The COVID-QA-el-small dataset is a Greek-language subset of 826 examples derived from the COVID-QA-el dataset, translated using machine translation. The dataset follows the SQuADv1.1 fashion style.

The original dataset, COVID-QA: A Question Answering Dataset for COVID-19 (ACL 2020) contains 2,019 question-answer pairs annotated by volunteer biomedical experts on scientific literature about COVID-19.